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探讨鱼腥草蛋白酶抑制剂的分离和纯化
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【中医学检验论文】摘要：目的以鱼腥草为材料，研究鱼腥草蛋白酶抑制剂(HCTI)的分离提取工艺。方法HCTI的最佳粗提条件是采用pH 7.0的双蒸水为提取溶剂，在体积比为1∶30， 45 ℃条件下浸提2.0 h，提取2次。硫酸铵部分沉淀后，再经DEAE-52离子交换层析柱纯化。结果粗提液经45％～60％饱和度的硫酸铵沉淀比活力最高，经过DEAE-52离子交换层析柱梯度洗脱后，检测到HCTI活性峰。结论用DEAE-52离子交换层析柱可分离纯化HCTI，SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，计算出该HCTI的分子量约为28 KDa。
关键词： 胰蛋白酶抑制剂； 鱼腥草； 分离纯化
胰蛋白酶抑制剂(Trypsin inhibitor ,TI)除了在临床上用来治疗急性胰腺炎、肺气肿、脑水肿和脑缺血外，目前还发现它在HIV和肿瘤的治疗中也有重要意义［1］。化学合成的TI生物利用度低、副作用大以及产生耐药性等缺点，植物来源的TI具有兼容性好、安全和特殊的药物特性等优点。因此，从传统中药中筛选具有TI有活性的材料有很广阔的应用前景和市场价值。
鱼腥草为三白草科植物蕺菜Houttuynia cordata Thunb的地上部分，具有清热解毒、消痈排脓、利尿通淋之功效，是临床应用极其广泛的中药之一。本文在前期研究的基础上，对鱼腥草中TI进行了分离纯化，获得的结果对开发植物来源的TI具有重要意义。
1 材料与仪器
1.1 试剂胰蛋白酶(北京麒麟宏伟公司) ，苯甲酰DL-精氨酸对硝基苯胺(上海三杰生物技术有限公司)，DEAE-纤维素(Sigma)，三-羟甲基-氨基甲烷，无水氯化钙，盐酸，三氯乙酸，氢氧化钠等为国产分析纯。
1.2 仪器可见光分光光度计，高速冰冻离心机，精密pH 计，数显恒温水浴锅，精密电子天平，蛋白质电泳仪等。
2 方法
2.1 鱼腥草胰蛋白酶抑制剂抑制率的测定参考杜旭东等［2，3］的苯甲酰DL-精氨酸对硝基苯胺(BAPNA)法。
2.2 鱼腥草胰蛋白酶抑制剂的分离与纯化参考康庄等［4］的方法进行。
3 结果
3.1 硫酸铵分级沉淀按照硫酸铵沉淀表，对样品浸提液添加硫酸铵至30％，45％，60％，75％饱和浓度，分别测定各浓度下的体积、抑制活性和蛋白浓度。pH值为6.0的样品浸提液实验结果见表1，pH值为8.0的样品浸提液实验结果见表2。表1 pH 6.0条件下硫酸铵分级沉淀TI的结果（略）表2 pH 8.0条件下硫酸铵分级沉淀TI的结果（略）
从图1可以看出，两种不同pH体系活性析出均集中于30％～75％饱和度，但45％～60％饱和度下比活力最高，且pH 8.0体系时比活力大。因此，在以后的纯化过程中，均采用pH 8.0溶液体系对样品液进行硫酸铵分级沉淀，加(NH4)2SO4至40％饱和度，以除去碱性或中性杂蛋白。再加(NH4)2SO4至60％饱和度，收集沉淀，溶解透析供下步离子交换层析用。抑制剂的析出在pH 6.0体系比pH 8.0体系要早，这说明抑制剂可能是一种酸性蛋白。
3.2 DEAE-52离子交换分离纯化取pH 8.0 Tris-HCl缓冲液透析后的粗提液5 ml，上DEAE-52离子交换柱(ф 2.5 cm×15 cm),流速为0.75 ml/min，以50 ml缓冲液洗脱,使样品液压实，再分别用由缓冲液配制的60～400 mmol NaCl溶液进行梯度洗脱，所得各管洗脱液(每管收集3 ml)在紫外光280 nm下测其吸光度，检测蛋白含量，其梯度洗脱曲线见图2。
由图3可知, 在55～70号试管具有HCTI活性，以60～63号活性最高。收集60号试管及附近活性较高的试管保存，进一步处理后进行HCTI相对分子量的测定。洗脱液的浓度梯度与试管号的对应关系见表3。表3 洗脱液的浓度梯度与试管号的对应关系（略）
3.3 鱼腥草胰蛋白酶抑制剂的相对分子量的测定
DEAE-52离子交换柱分离纯化后HCTI液的活性峰经SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳。结果如图4。
由电泳图谱上测定的标准蛋白相对迁移率及其分子量，待测蛋白的迁移率为0.530。经计算机处理数据后，得回归方程：LogY=－1.355X+5.165 3 如图5所示，将待测的蛋白相对迁移率带入方程，计算出HCTI的分子量约为28 kDa。
4 讨论
本实验在粗提过程中采用分级盐析法除掉了部分杂蛋白，分离过程中用到了DEAE-52离子交换层析法，并检测到活性峰。说明分级盐析发挥了一定作用，从而简化了分离纯化过程，测得HCTI分子量约为28 kDa。为该胰蛋白酶抑制剂的进一步深入研究奠定了一定的理论基础。
【参考文献】
［1］刘同祥,牛建昭,杜旭东,等.具有蛋白酶抑制剂活性成分中药的筛选［J］.中国中药杂志, 2007, 32 (7) :643.
［2］杜旭东,刘同祥,张宗申,等.正交实验法优选鱼腥草胰蛋白酶抑制剂的提取工艺［J］.时珍国医国药,2007,18(10):2337.
［3］杜旭东,刘同祥,张宗申,等.超声波法提取胰蛋白酶抑制剂［J］.时珍国医国药,2008,19(3):525.
［4］康 庄,王 竞,杜林方.菠菜种子胰蛋白酶抑制剂的分离纯化与部分性质研究［J］.天然产物研究与开发,2005,17(2):143.
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