|
|
|
|
姜黄素抗As2O3诱变作用的实验研究
|
|
【中医学检验论文】【摘要】 目的：研究姜黄素抗三氧化二砷（As2O3）的诱变作用。方法：分别采用小鼠骨髓细胞和人外周血淋巴细胞微核（MN）实验，计数含有MN的嗜多染红细胞和淋巴细胞数，计算MN率。观察As2O3细胞诱变性及不同浓度姜黄素对As2O3诱变性作用的影响。结果：①小鼠骨髓MN试验：与As2O3组比较，As2O3+1.2 mg/mL，2.4 mg/mL，4.8 mg/mL姜黄素组小鼠骨髓细胞MN率显著降低（P＜0.05，P＜0.01）。②人外周血淋巴细胞MN试验：与空白对照组比较，1 μg/mL、2 μg/mL、4 mg/mL As2O3组人外周血淋巴细胞MN率升高（P＜0.01）；与1 μg/mL（2 μg/mL、4 μg/mL）As2O3组比较，5 μg/mL，10 μg/mL，20 μg/mL姜黄素+1 μg/mL（2 μg/mL，4 μg/mL）As2O3组MN率降低（P＜0.05，P＜0.01）。结论: As2O3具有剂量相关的致突变作用，姜黄素具有明确的抗As2O3诱变性作用。
【关键词】 姜黄素；三氧化二砷；诱变性
Abstract Objective：To observe the inhibitive effect of curcumine against mutagenicity of As2O3 . Methods：①Micronucleus（MN） frequency test in bone marrow of mice: 60 mice were randomly divided into blank control group，As2O3 group and 1.2 μg/mL，2.4 μg/mL，4.8 μg/mL curcumine+As2O3 group（n=12）.Blank control group and As2O3 group were administered salad oil through intragastrical perfusion for 7 days.Then blank control group was injected intraperitoneally with 0.5 mL saline，other three groups were injected with 0.5 mL As2O3 solution（20 μg/mL）.24 h later，mice were sacrificed and MN frequency test in bone marrow of mice was made.②MN frequency test in peripheral blood lymphocyte of human：human blood samples were divided into 13 groups：blank control group，1 μg/mL，2 μg/mL，4 μg/mL As2O3 group，5 μg/mL，10 μg/mL，20 μg/mL curcumine+1 μg/mL（2 μg/mL，4 μg/mL）As2O3 group.Then MN frequency test in peripheral blood lymphocyte of human was made to study mutagenicity of As2O3.Results：①Compared with As2O3 group，MN frequency in 1.2 mg/mL，2.4 mg/mL，4.8 mg/mL curcumine+As2O3 group were significantly decreased（P＜0.05，P＜0.01）.②Compared with 1 μg/mL （2 μg/mL，4 μg/mL） As2O3 group，MN frequency in 5 μg/mL，10 μg/mL，20 μg/mL curcumine+1 μg/mL （2 μg/mL，4 μg/mL） As2O3 group were significantly decreased（P＜0.05，P＜0.01）.Conclusion：As2O3 has dosage-correlative mutagenic effect，and curcumine has a remarkable antimutagenic effect against As2O3.
Key words curcumine，As2O3，mutagenicity 姜黄素（curcumine）是从中草药姜黄（curcuma aromatica）中提取的一种酚性食用色素。近年来，国内外许多学者证实姜黄素本身不具有诱变性，并可明显抑制某些致突变物的诱变作用。有研究报道，姜黄素的抗诱变作用可能是通过改变诱变物的代谢活性来实现的［1 - 2］。本课题以小鼠骨髓微核实验验证姜黄素拮抗As2O3的诱变性作用，并以人外周血淋巴细胞微核实验来检验姜黄素抗As2O3诱变作用的量效关系，在此基础上，探讨姜黄素抗诱变作用的可能机理，为研制开发抗诱变药品和保健品提供实验依据。
1 材料与方法
1.1 实验材料
1.1.1 实验动物 昆明种小鼠60只，体重（20±2）g，雌雄不分。
1.1.2 药品与试剂 姜黄素为上海三爱思公司产品，用时分别以色拉油溶解为4.8 mg/mL、2.4 mg/mL、1.2 mg/mL浓度溶液（用于小鼠骨髓MN实验）和以少量DMSO 溶解后用无血清培养基稀释为110 g/mL、220 g/mL、440 g/mL浓度的溶液（用于人外周血淋巴细胞MN实验）。As2O3注射液（5 mmoL/10 mL）为哈尔滨伊达药业有限公司产品，用时分别以生理盐水（用于小鼠骨髓MN实验）和无血清培养基（用于人外周血淋巴细胞MN实验）稀释为各浓度溶液。RPMI-1640培养液：用分析天平称取RPMI-1640粉剂4.16 g、碳酸氢钠0.8 g溶于400 mL双蒸水，加入新生牛血清100 mL、2万U/mL链霉素溶液2.5 mL、2万U/mL青霉素溶液2.5 mL，充分混匀，用5%碳酸氢钠溶液和1 moL/L盐酸溶液调节pH值至7.0~7.2，过滤除菌保存待用。改进方法参照文献［3］进行。
1.2 实验方法 ［3］
1.2.1 小鼠骨髓MN实验
1.2.1.1 分组与给药 60只小鼠随机分为空白对照组、As2O3组、As2O3+1.2 mg/mL姜黄素组、As2O3+2.4 mg/mL姜黄素组、As2O3+4.8 mg/mL姜黄素组5组，每组12只。空白对照组、As2O3组小鼠每天0.5 mL色拉油灌胃，As2O3+1.2 mg/mL姜黄素组、As2O3+2.4 mg/mL姜黄素组、As2O3+4.8 mg/mL姜黄素组小鼠每天分别灌胃0.5 mL的2.4 mg/mL、4.8 mg/mL、9.6 mg/mL姜黄素溶液，连续灌胃7 d。7 d后，空白对照组腹腔注射0.5 mL生理盐水，其他各组腹腔注射等量20 μg/mLAs2O3溶液，24 h后处死小鼠，处死前4 h每只小鼠腹腔注射5 μg/mL秋水仙素溶液0.5 mL。
1.2.1.2 微核制片 采用直接涂片法。颈椎脱臼处死小鼠，取胸骨，用止血钳挤出骨髓于事先放有一滴新生牛血清的载玻片上，均匀推片。标本自然干燥后放入甲醇中固定5 min，再次干燥后用Giemsa染液（pH6.8）染色10 min，清水冲洗后晾干，写好标签。-20 ℃保存。
1.2.1.3 阅片 用双盲法阅片，选择细胞完整、分散均匀、着色适当的区域，在油镜下观察并计数。每例标本计数1 000个嗜多染红细胞，计数含有微核的嗜多染红细胞，计算微核率。
1.2.2 人外周血淋巴细胞MN实验
1.2.2.1 实验分组 共设13个组，即空白对照组，1 μg/mL As2O3组、2 μg/mL As2O3组、4 μg/mL As2O3组，5 μg/mL姜黄素+1 μg/mL As2O3组、10 μg/mL姜黄素+1 μg/mL As2O3组、20 μg/mL姜黄素+1 μg/mL As2O3组、5 μg/mL姜黄素+2 μg/mL As2O3组、10 μg/mL姜黄素+2 μg/mL As2O3组、20 μg/mL姜黄素+2 μg/mL As2O3组、5 μg/mL姜黄素+4 μg/mL As2O3组、10 μg/mL姜黄素+4 μg/mL As2O3组、20 μg/mL姜黄素+4 μg/mL As2O3组。
1.2.2.2 细胞培养 按无菌操作将抗凝的新鲜人外周血接种到装有5 mL RPMI-1640培养液的玻璃瓶中，上述各组每组3瓶，每瓶接种0.5 mL，再加入PHA溶液0.3 mL，轻轻摇匀后，将玻璃瓶放入CO2培养箱，37 ℃恒温培养。
1.2.2.3 处理方法 培养24 h后，用无菌注射器向各浓度As2O3组各瓶中加入不同浓度的As2O3溶液0.5 mL，使终浓度分别为1 μg/mL、2 μg/mL、4 μg/mL；姜黄素+As2O3组各瓶中加入不同浓度的姜黄素溶液及As2O3溶液各0.25 mL，使终浓度分别为5 μg/mL姜黄素+1 μg/mL As2O3、10 μg/mL姜黄素+1 μg/mL As2O3、20 μg/mL姜黄素+1 μg/mL As2O3、5 μg/mL姜黄素+2 μg/mL As2O3、10 μg/mL姜黄素+2 μg/mL As2O3、20 μg/mL姜黄素+2 μg/mL As2O3、5 μg/mL姜黄素+4 μg/mL As2O3、10 μg/mL姜黄素+4 μg/mL As2O3、20 μg/mL姜黄素+4 μg/mL As2O3。
1.2.2.4 染色体制片 加药后于CO2培养箱中，37 ℃恒温避光培养44 h。加入秋水仙素溶液（终浓度为0.05 μg/mL），继续培养4 h后收获细胞，经离心、低渗、固定等步骤后，空气干燥法制片，干燥后用Giemsa染液（pH6.8）染色10 min，清水冲洗后晾干，写好标签。
1.2.2.5 阅片 用双盲法阅片，选择细胞完整、分散均匀，着色适当的区域，在油镜下观察并计数。每例标本计数1 000个转化淋巴细胞，计数含有微核的转化淋巴细胞，计算微核率。
1.3 统计方法
所有数据采用SPSS11.0软件分析，实验结果均以（x±s）表示，组间比较采用t检验。
2 结 果
2.1 小鼠骨髓细胞MN率比较
结果见表1。由表1可以看出，与As2O3组比较，As2O3+1.2 mg/mL姜黄素组、As2O3+4.8 mg/mL姜黄素组和As2O3+2.4 mg/mL姜黄素组MN率明显降低（P<0.05，P<0.01）。
2.2 人外周血淋巴细胞MN率比较
3 讨 论
本实验采用的是双材料研究，即以昆明种小鼠骨髓细胞及人外周血淋巴细胞为双材料，双双印证，以求得结果准确可靠。至今已发现相当数量的外源性化学物能损伤遗传物质，从而诱发突变。研究诱变的方法有多种，本研究所采用的微核试验正越来越受到重视，国内外在药物的致突变的检测中均将微核试验列为第一阶段致突变试验 ［4］。其优点是快速、简便、不需要特殊试剂及设备；不要求有良好的核型；染色体数目多、形状小，不适于进行中期染色体畸变分析的动物，仍可进行微核试验。抗诱变研究中采用的诱变剂主要有紫外线等物理因素及环磷酰胺、苯并芘、烟草等化学物品。本课题选取的是文献已报道有一定诱变活性的As2O3作为诱变剂，As2O3是中药砒霜的主要成分，研究证实低浓度As2O3具有诱变性 ［5］。
目前已发现许多中药具有抗突变效应，能通过抑制诱变剂的诱变作用，减少DNA损伤并增加其损伤修复能力，从而达到其抗诱变作用 ［6-7］，从天然产物中寻找和筛选抗诱变剂已引起世界各国的普遍关注，并且取得了较大进展。
关于癌变的体细胞多次突变理论认为，机体细胞癌变至少需要经过两次以上的基因突变。当与肿瘤发生相关的基因发生某种变异后，原癌基因活化成癌基因，抑癌基因则失活甚至转变为癌基因。姜黄素本身为非诱变剂，且具显著的抗突变作用，这可能是姜黄素对肿瘤初始形成阶段的抑制效应的可能机制之一。姜黄素来源广泛，价格低廉，无毒副作用，随着对姜黄素抗癌作用研究的深入，姜黄素作为一种新型植物来源的癌化学预防药物将具有良好的应用前景。
【参考文献】
［1］Azuine M A，Kayal J J，Bhide S V.Protective role of aqueous turmeric extract against mutagenicity of direct-acting carcinogens as well as benzo［alpha］ pyrene-induced genotoxicity and carcinogenicity［J］.J Cancer Res Clin Oncol，1992，118（6）：447-452.
［2］Naqabhushan M，Bhide S V.Nonmutagenicity of curcumin and its antimutagenic action versus chili and capsaicin［J］.Nutr Cancer，1986，8（3）：201-210.
［3］赵刚.医学细胞生物学实验与习题［M］.北京：科学出版社，1999：53.
［4］Parton J W，Hoffman W P，Garriott M L.Validation of an automated image analysis micronucleus scoring system［J］.Mutat Res，1996，370（1）：65-73.
［5］祝寿芬，仇玉兰，王仲霞.三氧化二砷对小鼠精子形态的影响［J］.卫生毒理学杂志，1997，11（2）：122-123.
［6］董彩婷，杨青，肖元梅，等.芦荟多糖抗突变作用的试验研究［J］.华西医科大学学报，2002，33（3）：477-478.
［7］杨胜利，韩绍印，张巧，等.冬凌草甲素抗突变性研究［J］.癌变·畸变·突变，2001，13（1）：8-10.
|
|
|
|
广告服务