| 摘要 | 第1-15页 |
| Abstract | 第15-17页 |
| 1 前言 | 第17-38页 |
| ·苹果的分布和起源 | 第17-19页 |
| ·植物的颜色 | 第19-20页 |
| ·类胡萝卜素 | 第19页 |
| ·甜菜素 | 第19页 |
| ·花青苷 | 第19-20页 |
| ·花青苷在植物中的作用 | 第20-21页 |
| ·花青苷和人类的健康 | 第21页 |
| ·花青苷的生物合成途径 | 第21-25页 |
| ·查尔酮合成酶（CHS） | 第22页 |
| ·查尔酮异构酶（CHI） | 第22页 |
| ·黄烷酮3-羟化酶（F3H） | 第22-23页 |
| ·二羟基黄酮醇还原酶（DFR） | 第23页 |
| ·第三阶段是各种花青苷的形成 | 第23-25页 |
| ·运输和储存 | 第25页 |
| ·影响花青苷颜色的因素 | 第25-26页 |
| ·影响花青苷的环境因子 | 第26-29页 |
| ·光照对花青苷的影响 | 第27-28页 |
| ·温度对着色的影响 | 第28-29页 |
| ·全球气候变暖 | 第29-30页 |
| ·转录因子 | 第30-37页 |
| ·MYB 转录因子 | 第31-33页 |
| ·bHLH 转录因子 | 第33-35页 |
| ·WD40 蛋白 | 第35页 |
| ·WD40-bHLH-MYB 蛋白复合体共同调控花青苷 | 第35-37页 |
| ·研究的目的和意义 | 第37-38页 |
| 2 材料和方法 | 第38-67页 |
| ·菌株和基因型 | 第38页 |
| ·植物材料 | 第38页 |
| ·本文中用到的载体 | 第38页 |
| ·酶及生化试剂 | 第38-39页 |
| ·PCR 引物 | 第39页 |
| ·培养基 | 第39页 |
| ·抗生素 | 第39-40页 |
| ·溶液和缓冲液 | 第40-41页 |
| ·细菌转化方法 | 第41-42页 |
| ·大肠杆菌DH5α和BL21 感受态的制备与转化 | 第41页 |
| ·根癌农杆菌感受态细胞的制备与转化 | 第41-42页 |
| ·花青苷测定 | 第42-43页 |
| ·花青苷测定原理 | 第42页 |
| ·花青苷提取步骤 | 第42-43页 |
| ·原花青苷染色 | 第43页 |
| ·植物转化方法 | 第43-45页 |
| ·拟南芥转化 | 第43页 |
| ·瞬时转化烟草叶片，双荧光素检测 | 第43-44页 |
| ·洋葱表皮的转化 | 第44页 |
| ·苹果的转化 | 第44-45页 |
| ·苹果愈伤的转化 | 第45页 |
| ·苹果细胞悬浮系的培养 | 第45页 |
| ·DNA 技术 | 第45-46页 |
| ·质粒DNA 的提取 | 第45-46页 |
| ·RNA 提取及cDNA 合成 | 第46-47页 |
| ·CTAB 法RNA 提取步骤 | 第46-47页 |
| ·cDNA 链的合成 | 第47页 |
| ·MdTTL1 基因的克隆 | 第47-50页 |
| ·PCR 产物的回收 | 第48-49页 |
| ·连接反应 | 第49页 |
| ·DNA 序列测定 | 第49页 |
| ·序列分析 | 第49-50页 |
| ·MdTTL1 启动子的克隆 | 第50页 |
| ·表达载体构建 | 第50-52页 |
| ·连接DNA 的准备 | 第50-51页 |
| ·MdTTL1-GFP 融合蛋白表达载体的构建 | 第51页 |
| ·pMdUFGT::GUS 表达载体的构建 | 第51页 |
| ·PET30-MdTTL1 原核表达载体的构建 | 第51页 |
| ·pSPYNE-MdTTL1, pS-PYCE-MdTTL1 双分子荧光互补载体的构建 | 第51-52页 |
| ·pRV-MdTTL1 载体构建 | 第52页 |
| ·pMdTTL1::GUS 载体构建 | 第52页 |
| ·蛋白技术 | 第52-55页 |
| ·原核表达MdTTL1 蛋白 | 第52页 |
| ·纯化MdTTL1 蛋白 | 第52-55页 |
| ·纯化步骤 | 第53-54页 |
| ·考马斯亮蓝染色 | 第54页 |
| ·快速银染法 | 第54页 |
| ·聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE） | 第54-55页 |
| ·抗体制备 | 第55页 |
| ·Western 分析蛋白 | 第55-56页 |
| ·转膜（湿转法） | 第55页 |
| ·Western Blot | 第55-56页 |
| ·酵母双杂转化方法 | 第56-59页 |
| ·酵母双杂培养基 | 第57-58页 |
| ·其它贮备液 | 第58-59页 |
| ·凝胶变动迁移率实验EMSA | 第59-62页 |
| ·EMSA 探针标记 | 第59页 |
| ·生物素标记EMSA 探针的制备 | 第59-60页 |
| ·制备6%非变性聚丙烯酰胺凝胶 | 第60页 |
| ·DNA 探针与蛋白质结合 | 第60-61页 |
| ·电泳和转膜 | 第61页 |
| ·核酸（DNA）检测方法 | 第61-62页 |
| ·染色质免疫共沉淀（ChIP） | 第62-64页 |
| ·染色质交联 | 第62-64页 |
| ·GUS 组织化学染色 | 第64-66页 |
| ·X-Gluc 溶液配制 | 第64页 |
| ·GUS 染色液的配制 | 第64页 |
| ·GUS 基因表达的定量分析 | 第64-66页 |
| ·植物总蛋白的提取 | 第66-67页 |
| 3 结果与分析 | 第67-100页 |
| ·适当的低温促进花青苷的积累 | 第67-69页 |
| ·红星果实的处理 | 第67页 |
| ·着色苹果的花青苷测定 | 第67-68页 |
| ·苹果着色结构基因的表达分析 | 第68-69页 |
| ·低温响应转录因子的筛选与克隆 | 第69-76页 |
| ·低温响应转录因子的筛选 | 第69页 |
| ·低温响应转录因子MdTTL1 基因的克隆及序列分析 | 第69-73页 |
| ·MdTTL1 的基因克隆 | 第69-70页 |
| ·MdTTL1 序列分析 | 第70页 |
| ·bHLH 蛋白的系统进化分析 | 第70-73页 |
| ·MdTTL1 启动子的克隆 | 第73页 |
| ·植物表达载体的构建和GUS 染色 | 第73页 |
| ·新红星果实着色过程中MdTTL1 的基因表达分析 | 第73-74页 |
| ·MdTTL1 的时空表达 | 第74页 |
| ·MdTTL1 在4℃低温处理下的表达分析 | 第74页 |
| ·果实着色过程MdTTL1 的蛋白表达 | 第74-75页 |
| ·pIR-MdTTL1-anti 抑制果实着色 | 第75-76页 |
| ·MdTTL1 通过与MdMYB1 互作共同调控果实着色 | 第76-80页 |
| ·酵母双杂证明MdTTL1 与MdMYB1 互作 | 第76-79页 |
| ·载体的构建 | 第76-77页 |
| ·诱饵蛋白自主激活检测 | 第77页 |
| ·酵母双杂检测MYB 与bHLH 互作 | 第77-79页 |
| ·双分子荧光互补（BiFC） | 第79-80页 |
| ·结果检测 | 第79-80页 |
| ·MdTTL1 结合到MdDFR 和MdUFGT 的启动子上直接调控花青苷代谢 | 第80-90页 |
| ·MdDFR 和MdUFGT 的启动子的克隆与序列分析 | 第80-81页 |
| ·EMSA 离体验证MdTTL1 结合到MdDFR 和MdUFGT 启动子上 | 第81-85页 |
| ·MdTTL1 的原核表达及纯化 | 第82-84页 |
| ·MdTTL1 与E-box 元件和LTR 元件结合 | 第84-85页 |
| ·苹果愈伤活体验证MdTTL1 直接结合MdDFR 和MdUFGT 启动子（ChIP） | 第85-90页 |
| ·PUFGT::GUS 表达载体的构建及活性验证 | 第88-90页 |
| ·转基因验证MdTTL1 的功能 | 第90-99页 |
| ·愈伤中MdTTL1 过量表达对花青苷的影响 | 第90-91页 |
| ·低温诱导MdTTL1 快速磷酸化影响MdDFR 和MdUFGT 的结合活性 | 第91-93页 |
| ·低温增强了MdTTL1 结合MdDFR 和MdUFGT 启动子的能力 | 第92-93页 |
| ·MdTTL1 在组培苗中验证功能 | 第93-96页 |
| ·MdTTL1 基因植物表达载体构建 | 第93页 |
| ·pBI121-MdTTL1 转基因苹果的获得 | 第93页 |
| ·低温有利于MdTTL1 转基因组培苗花青苷积累 | 第93-94页 |
| ·MdTTL1 过量表达促进叶片中原花青苷含量表达 | 第94-96页 |
| ·MdTTL1 对果实着色的影响 | 第96-99页 |
| ·MdTTL1 瞬时表达载体构建 | 第96-97页 |
| ·MdTTL1 结合MdMYB1 的启动子调控其表达 | 第97-99页 |
| ·MdTTL1 低温调控苹果着色的工作模型 | 第99-100页 |
| 4 讨论 | 第100-105页 |
| ·MdTTL1 受低温诱导并且正调控花青苷合成 | 第100页 |
| ·MdTTL1 能够与MdMYB1 互作 | 第100-102页 |
| ·MdTTL1 通过结合到MdDFR 和MdUFGT 的启动子上直接调控其表达 | 第102页 |
| ·MdTTL1 在低温下通过转录和翻译后修饰两个水平调控花青苷的合成 | 第102-103页 |
| ·MdTTL1 与CBF 启动子结合整合低温信号和GA 信号诱导苹果果实着色 | 第103-105页 |
| 5 结果和推论 | 第105-107页 |
| ·结果 | 第105-106页 |
| ·推论 | 第106页 |
| ·展望 | 第106-107页 |
| 6 参考文献 | 第107-124页 |
| 7 附录 | 第124-134页 |
| ·本文中使用的引物 | 第124-128页 |
| ·表达载体示意图 | 第128-130页 |
| ·MdTTL1 基因的cDNA 序列 | 第130-132页 |
| ·MdTTL1 的启动子序列 | 第132-133页 |
| ·MdTTL1 的启动子顺式作用元件分析 | 第133-134页 |
| 8 致谢 | 第134-135页 |
| 9 攻读学位期间发表的论文 | 第135页 |
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