|
聚酰胺抑制基因转录研究进展其它医学
|
|
【中医妇科论文】【摘要】 聚酰胺（polyamide）是一类人工合成的小分子，能以序列特异性与DNA小沟结合，从而干扰天然转录因子与特定DNA序列的结合，实现对特定基因表达的调控。此类小分子 发展 迅速，近年来与烷化剂连接而提出了基因沉默新途径，具有特异基因 治疗 的潜力。本文 总结 了聚酰胺对特定基因转录抑制的 研究 进展。
【关键词】 聚酰胺 启动子 基因转录；转录因子
Suppression of Gene Transcription by Polyamide —— Review
Abstract Polyamide is a synthetic small molecule that recognizes predetermined sequences in the minor groove of DNA with affinities and specificities compared to those of DNAbinding proteins. Polyamide can suppress gene transcription by interfering with the attachment of natural transcription factors and DNA. The alkylating polyamides represent a novel approach for sequencespecific gene silencing , which might be applied to gene therapy. The research on suppression of gene transcription by polyamide was reviewed in this paper.
Key words polyamide；promoter；gene transcription; transcription factor
真核生物基因表达最重要的环节是转录水平的调控，人工合成的能够与DNA序列识别和结合的小分子成为化学、分子生物学及医学等领域关注的焦点之一。继DNA、RNA反义技术和RNA干扰（RNAi）技术之后，能够识别DNA序列的聚酰胺（polyamide）分子的研究十分引人注目［1］。聚酰胺是人工合成的小分子，由芳环通过酰胺键连接而成。已经发现，这些小分子不仅具有识别DNA碱基的序列选择性, 还有易穿透细胞膜的功能［2，3］。最近报道的一些实验表明，聚酰胺成功地抑制了一些基因的转录，尤其是人类免疫缺陷病毒（HIV）基因和一些肿瘤基因的转录，具有特异性基因治疗的潜力。
聚酰胺化学结构及其与DNA的识别
最初的发现是从抗肿瘤抗生素“偏端霉素”开始的，这是 自然 界存在的识别DNA的天然小分子，能够与DNA小沟(尤其是AT富集区)结合。受此结构启发, Gottefeld及一些研究者［3-7］合成了一些ImPyPyDp分子(Im=N甲基咪唑；Py= N甲基吡咯；Dp=N,N二甲基丙胺)，合成的两个聚酰胺分子平面相对，与DNA小沟呈反向平行状态，每个聚酰胺分子上的酰胺键分别与相邻的DNA碱基形成氢键，结合在DNA的WGWCW序列上(W可以是A或者T)。他们进一步用一个氨基酸分子作为连接子，将两条反向平行聚酰胺链的C端与N端连接起来，形成了头尾相连发卡状(hairpin) 聚酰胺。这种发卡状聚酰胺与DNA的亲合性比独立的两条聚酰胺链提高了约400倍。几种连接子的对比实验显示,由γ氨基丁酸充当连接子时聚酰胺具有最好的亲合性。进一步研究发现，γ氨基丁酸不仅充当连接子,还具有一定序列选择性 (γ氨基丁酸和β丙氨酸与A·T/T·A的结合性相对G·C/C·G要强200-400倍)。聚酰胺识别DNA的配对规则是：从氨基端到羧基端反向平行成对的Py/Im特异识别C·G碱基对,而Im/Py识别G·C碱基对；反向平行成对的Hp/Py(Hp= N甲基3羟基吡咯)特异识别T·A碱基对, 而Py/Hp识别A·T碱基对。利用这个规则,可以针对某一段已知DNA序列设计出相应的聚酰胺识别分子,然后进行生物活性的测试与 分析 。聚酰胺识别DNA序列的亲和力和特异性还可以通过化学 方法 将两个分子连接起来
本综述由北京大学第一 医院 朱平教授审校形成串联聚酰胺而得到提高，并且这种串联分子可以识别更长的序列。
不论是无细胞DNA模型，体外细胞培养以及动物实验都证实聚酰胺可以抑制基因转录。设计的聚酰胺与DNA小沟特定序列结合（通常是基因调控区启动子/增强子元件），阻断真核转录因子（或病毒转录因子）与靶序列的结合，从而抑制特定基因的表达［8，9］。
体外无细胞DNA实验
最初的实验是在无细胞条件下进行的，Gottesfeld等［3］设计了含有8个环的发卡状聚酰胺，从非洲蟾蜍肾脏来源的成纤维细胞分离出染色体，该聚酰胺可以与5SRNA 基因的启动子元件结合，抑制转录因子TFⅢA与此元件结合，阻断RNA聚合酶Ⅲ的转录。
TATA 盒是大多数真核生物基因调控区的核心启动子，与其结合的蛋白TBP是大多数真核生物共用的转录因子。人类免疫缺陷病毒1（HIV1）基因调控区也含有TATA 盒。Ehley等［10］设计了多个聚酰胺分子，分别针对HIV1基因 TATA 盒上游或下游（-55 bp-+1 bp范围内）不同序列，这些聚酰胺都能阻断RNA聚合酶Ⅱ的转录，表明除了TATA 盒外，还存在其他重要的调控元件。
聚酰胺抑制特定基因转录的特点可以用来研究转录因子的相互作用。实验表明，设计识别HIV1增强子/启动子中ETS1元件的聚酰胺阻断转录因子ETS1与DNA大沟结合后，又能阻断NFkB与DNA结合，从而引起HIV1转录抑制［11］。这就提示，在调控HIV1基因表达时NFkB和ETS1存在相互作用，而且这种相互作用非常重要。
聚酰胺还可以抑制某些肿瘤基因的转录。Chiang等［12］发现与人类乳腺癌HER2/neu 基因启动子中ETS元件(5′GAGGAA3′)结合的聚酰胺能阻断转录因子ETS与该元件结合，抑制HER2/neu基因的表达。
人类的拓扑异构酶Ⅱa是某些化疗药物（如依托泊苷）作用的靶点。该酶基因启动子含有5个反向的CCAAT盒（inverted CCAAT box，ICB），即5′ ATTGG3′和互补链3′ TAACC5′。在肿瘤细胞中，核因子Y结合到ICB2可以抑制拓扑异构酶Ⅱa的表达，造成肿瘤细胞对某些化疗药物产生抵抗。人类多药耐药基因1（MDR1）编码的糖蛋白参与肿瘤细胞对多种化疗药物产生耐药的机制。MDR1基因启动子中也含有ICB，核因子Y结合到ICB并不 影响 糖蛋白的基础表达水平，但是可以上调化疗药物诱导的MDR1基因的转录。
所有的ICBs都是相同的，但是其侧翼却有区别。如果设计合适的聚酰胺分子，干扰核因子Y与启动子ICB的结合，将有可能成为抗肿瘤药物和基因调节药物的一种新方法。
拓扑异构酶Ⅱa启动子ICB2和ICB3的3’侧翼是相似的(5′ATTGGTT3′)，Henry等［13］合成了针对5′TTGGT3′的聚酰胺JH37，凝胶迁移率和DNase I足迹试验表明，JH37优先与ICB2和ICB3结合，并且JH37具有较好的细胞摄取率。MDR1启动子ICB及其侧翼序列：5′ ATTGGCT 3′（下划线处为ICB），Buchmueller等［14］设计了聚酰胺分子ZT65B，靶序列为5′(A/T)GGC(A/T) 3′，该序列也在拓扑异构酶Ⅱa启动子ICB1和ICB5 的3′侧翼出现，分别是ATTGGCT 和ATTGGCA（下划线处为ZT65B靶序列）。ZT65B能够以较高亲和力与MDR1启动子ICB结合，还能与拓扑异构酶Ⅱa启动子ICB1和ICB5结合，但是不能与ICB2、ICB3或ICB4结合。ZT65B和JH37可以作为构建新型聚酰胺分子的原型，特异性结合具有ICB的基因，影响一种或几种蛋白的表达。
体外细胞培养实验
无细胞条件下的DNA模型实验表明，聚酰胺能够抑制特定基因的转录，继之人们又开始了对细胞培养体系的观察。HIV1增强子/启动子中有多种转录因子(TBP、ETS1和LEF1等)的识别序列，Dickinson等［15］合成了分别与HIV1基因TATA 盒、LEF1元件和ETS1元件侧翼序列匹配和错配的聚酰胺，结果发现匹配的聚酰胺能够抑制转录因子与靶序列结合，进而抑制RNA聚合酶Ⅱ的转录，而错配的聚酰胺没有上述效应；联合 应用 多个匹配的聚酰胺可以阻断病毒的转录和复制。
某种聚酰胺能够进入人类T细胞白血病病毒1（HTLV1） 感染的T细胞，与细胞核内HTLV1 启动子中富含GC的序列（ CRE元件）结合，抑制病毒蛋白TAX与CRE元件合，从而抑制HTLV1基因转录，减少病毒颗粒的产生［16］。这些结果提示了一种新的抗病毒方法。
Lai等［17］合成了与转化生长因子beta1（TGFβ1）启动子FSE2元件（fatspecific element 2 )侧翼碱基序列（-545 bp至-539 bp）匹配及错配的聚酰胺，凝胶迁移率试验证明匹配的聚酰胺能够与DNA相应序列结合，错配的聚酰胺不能与该序列结合。将匹配的聚酰胺加入人平滑肌细胞培养体系中共同孵育48小时，TGFβ1启动子的活性显著降低，TGFβ1 mRNA和蛋白表达受到抑制。
血管内皮生长因子（VEGF）是肿瘤血管生成的重要促进因子，Olenyuk等［18］设计了聚酰胺分子，它能够与VEGF启动子中低氧应答元件（hypoxia response element，HRE）结合，将其加入到HeLa细胞培养体系中共同孵育48小时后，VEGF mRNA和蛋白的表达水平都明显下降。这种聚酰胺分子有可能成为抗血管生成的新型制剂。
基因表达受多种转录因子调控，其识别序列通常是保守的。利用聚酰胺结合启动子来抑制基因表达则要求靶序列必须唯一，故而通常选取保守序列附近具有基因独特性的侧翼序列。如果设计针对编码区的聚酰胺将更加直接和特异，但是Gottesfeld［19］小组的研究表明，结合到基因编码区的聚酰胺并不能阻止RNA聚合酶的延伸。
Wurtz等［20］和Wang等［21］发现，将聚酰胺和瘤可宁等烷化剂连接成结合物后，识别DNA的序列特异性和亲和力仍然保存，并且能够在基因编码区将识别序列附近的腺嘌呤烷化，烷化效率具有时间依赖性和剂量依赖性。Oyoshi等［22］和Shinohara等［23］小组合成了一种具有乙烯基的聚酰胺烷化剂结合物，以序列特异性方式将基因编码区烷化，成功的抑制了转录。Shinohara小组又设计了两种聚酰胺－烷化剂结合物，细胞转染实验表明，结合物能够引起海鳃（renilla）和荧火虫（flyfire）的荧光素酶基因转录抑制。最近他们又有研究表明，具有吲哚连接子的聚酰胺CBI结合物能够特异性烷化绿色荧光蛋白基因编码区，引起基因沉默［1］。
动物体内实验
在动物体内进行的实验主要是以果蝇为对象，研究聚酰胺对胚胎发育的影响，针对特定基因的转录抑制实验报道较少。Dickinson等［24］设计的一种聚酰胺－瘤可宁结合物可以作用于组蛋白H4C基因编码区，抑制多种肿瘤细胞系的增殖，并且该结合物在荷瘤小鼠体内同样具有生物活性。Matsuda等［25］以DahlS小鼠为模型，设计了一种针对TGFβ1基因启动子AP1元件的聚酰胺，能明显抑制小鼠肾小球系膜细胞中该基因启动子的活性；荧光素标记的聚酰胺静脉注射小鼠后可分布到肾脏，显著抑制肾脏皮质中TGFβ1 mRNA和蛋白的表达，并且不依赖于血压变化就能减少尿蛋白。这种聚酰胺分子有可能治疗TGFβ1高表达相关的疾病。
聚酰胺可以进入特定类型细胞的细胞核
Chiang等［12］发现，在体外无细胞DNA实验中，与乳腺癌HER2/neu 基因启动子ETS元件结合的聚酰胺能抑制该基因转录，但是在细胞培养实验中并未得到同样结果。Supekova等［26］合成了聚酰胺，在无细胞实验中能够与cyclin D1启动子LEF1元件结合，抑制细胞周期蛋白D1（cyclinD1）转录，然而细胞培养实验中并未观察到该基因下调。这就提出了疑问：聚酰胺是否能够进入所有类型细胞的细胞核？
最早进行这方面 研究 的是Janssen等［27］ 和Sun等［28］，分别检测了荧光素标记的聚酰胺在果蝇Kc 细胞和人类结肠癌细胞系DLD1中的定位，尽管二者都显示荧光素标记的聚酰胺能到达细胞核，但这些细胞却都经过了多聚甲醛固定。此后，Belitsky等［29］、Best［30］和Dudouet等［31］利用激光共聚焦显微镜检测了多种活细胞中聚酰胺的定位，研究表明聚酰胺能否进入细胞核主要取决于细胞类型。例如在SKBR3（人类乳腺癌细胞）、NB4（人类白血病细胞）、293（成纤维细胞）、Sf9 （昆虫细胞） 和 Kc（果蝇细胞）中，聚酰胺均可以进入胞质，但未见其进入胞核；而在T细胞系CEM、MT2 和PM1以及髓系细胞KYO1中观察到聚酰胺可以进入胞核。除了细胞类型以外，聚酰胺结构改变也会 影响 其进入细胞核的能力，例如，咪唑基团的位置明显影响聚酰胺进入细胞核的能力［32］。
结 语
目前 看来，在序列特异性识别结合DNA的化学小分子中，聚酰胺显示了独特的优越性，若引入新的功能基团（如烷化基团）,可设计出以识别为基础的多功能分子，选择性地影响DNA蛋白质相互作用,这一多功能分子可能成为基因调控（尤其是HIV基因和肿瘤基因）的有力工具。
目前设计的聚酰胺所针对的基因非常有限，聚酰胺识别的序列长度也较短（6 bp左右），序列特异性（长度）有待提高，但长度增加是有限的，同时亲和力也不一定会相应增加。目前的研究多处于细胞水平，整体水平的较少。进一步的研究将集中于如何恰当选择靶基因和靶序列，联合 应用 多个聚酰胺，发挥其特异性基因 治疗 的潜力。
【 参考 文献 】
1Shinohara K, Sasaki S, Minoshima M, et al. Alkylation of template strand of coding region causes effective gene silencing. Nucleic Acids Res， 2006; 34:1189-1195
2Trauger JW , Baird EE, Dervan PB. Recognition of DNA by designed ligands at subnanomolar concentrations. Nature,1996; 382（6591）: 559-561
3Gottesfeld JM, Neely L, Trauger JW，et al. Regulation of gene expression by small molecules. Nature, 1997;387（6629）: 202-205
4Dervan PB，Burli RW. Sequencespecific DNA recognition by polyamides. Curr Opin Chem Biol， 1999; 3：688-693
5White S, Bzewczyk JW, Turner JM, et al. Recognition of the four WatsonCrick base pairs in the DNA minor groove by synthetic ligands. Nature，1998; 391 (6666) : 468-471
6Geierstanger BH, Mrksich M , Dervan PB， et al. Design of a G.Cspecific DNA minor groovebinding peptide. Science,1994; 266(5185): 646-650
7Kielkopf CL , White SE, Szewczyk JW ，et al. A structural basis for recognition of A. T and T. A base pairs in the minor groove of BDNA. Science, 1998; 282(5386): 111-115
8Dervan PB. Molecular recognition of DNA by small molecules. Bioorg Med Chem, 2001;9： 2215-2235
9Dervan PB ,Edeison BS. Recognition of the DNA minor groove by pyrroleimidazole polyamide .Curr Opin Struct Biol, 2003;13： 284-299
10Ehley JA, Melander C, Herman D, et al. Promoter scanning for transcription inhibition with DNAbinding polyamides. Mol Cell Biol, 2002;22: 1723-1733
11Dickinson LA, Tranger JW, Baird EE, et al. Inhibition of Ets1 DNA binding and ternary complex formation between Ets1, NFkappaB, and DNA by a designed DNAbinding ligand. J Biol Chem, 1999;274: 12765-12773
12Chiang SY, Burli RW, Benz CC, et al. Targeting the ets binding site of the HER2/neu promoter with pyrroleimidazole polyamides. J Biol Chem, 2000; 275: 24246-24254
13Henry JA, Le NM, Nguyen B, et al. Targeting the inverted CCAAT box 2 in the topoisomerase II alpha promoter by JH37, an imidazolepyrrole polyamide hairpin: design, synthesis, molecular biology, and biophysical studies. Biochemistry, 2004; 43: 12249-12257
14Buchmueller KL, Taherbhai Z, Howard CM, et al. Design of a hairpin polyamide, ZT65B, for targeting the inverted CCAAT box (ICB) site in the multidrug resistant (MDR1) gene. Chembiochem, 2005; 6: 2305-2311
15Dickinson LA, Gulizia RJ, Trauger JW, et al. Inhibition of RNA polymerase II transcription in human cells by synthetic DNAbinding ligands. Proc Natl Acad Sci USA,1998; 95: 12890-12895
16Lenzmeier BA, Baird EE, Dervan PB, et al. The tax proteinDNA interaction is essential for HTLVI transactivation in vitro. J Mol Biol. 1999;291: 731-744
17Lai YM, Fukuda N, Ueno T, et al. Synthetic pyrroleimidazole polyamide inhibits expression of the human transforming growth factorbeta1 gene. J Pharmacol Exp Ther, 2005;315: 571-575
18Olenyuk BZ, Zhang gj, Kloco JM, et al. Inhibition of vascular endothelial growth factor with a sequencespecific hypoxia response element antagonist. Proc Natl Acad Sci USA, 2004;101：16768-16773
19Gottesfeld JM, Belitsky JM, Melander C, et al. Blocking transcription through a nucleosome with synthetic DNA ligands. J Mol Biol, 2002; 321：249-263
20Wurtz NR, Dervan PB. Sequence specific alkylation of DNA by hairpin pyrroleimidazole polyamide conjugates . Chem Biol, 2000;7: 153-161
21Wang YD, Dziegielewski J, Chang AY, et al. Cellfree and Cellular Activities of a DNA Sequence Selective Hairpin PolyamideCBI Conjugate. J Biol Chem, 2002; 277: 42431-42437
22Oyoshi T, Kawakami W, Narita A. Inhibition of transcription at a coding sequence by alkylating polyamide. J Am Chem Soc, 2003;125: 4752-4754
23Shinohara K, Narita A, Oyoshi T, et al. Sequencespecific gene silencing in mammalian cells by alkylating pyrroleimidazole polyamides. J Am Chem Soc, 2004;126: 5113-5118
24Dickinson LA, Burnett R, Melander C, et al. Arresting cancer proliferation by smallmolecule gene regulation. Chem Biol, 2004； 11： 1583-1594
25Matsuda H, Fukuda N, Ueno T, et al. Development of gene silencing pyrroleimidazole polyamide targeting the TGFbeta1 promoter for treatment of progressive renal diseases. J Am Soc Nephrol, 2006;17: 422-432
26Supekova L, Pezacki JP, Su AI, et al. Genomic effects of polyamide/DNA interactions on mRNA expression. Chem Biol, 2002; 9: 821-827
27Janssen S, Durussel T, Laemmli UK. Chromatin opening of DNA satellites by targeted sequencespecific drugs. Mol Cell, 2000; 6: 999-1011
28Sun XH, Baltimore D. An inhibitory domain of E12 transcription factor prevents DNA binding in E12 homodimers but not in E12 heterodimers. Cell, 1991; 64: 459-470
29Belitsky JM, Leslie SJ, Arora PS, et al. Cellular uptake of Nmethylpyrrole/Nmethylimidazole polyamidedye conjugates. Bioorg Med Chem, 2002; 10: 3313-3318
30Best TP, Edelson BS, Nickols NG, et al. Nuclear localization of pyrroleimidazole polyamidefluorescein conjugates in cell culture.Proc Natl Acad Sci USA, 2003;100: 12063-12068
31Dudouet B, Burnett R, Dickinson LA, et al. Accessibility of nuclear chromatin by DNA binding polyamides. Chem Biol, 2003;10: 859-867
32Edelson BS, Best TP, Olenyuk B, et al. Influence of structural variation on nuclear localization of DNAbinding polyamidefluorophore conjugates. Nucleic Acids Res, 2004;32: 2802-2818
|
|
|
广告服务