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氯氰菊酯降解菌的分离鉴定及其降解特性研究
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【动物西医学论文】【摘要】 目的 分离得到能高效降解氯氰菊酯的菌株。方法 采用选择性培养基从农药厂的污泥中进行富集和分离筛选高效菌株，并且用16S rDNA序列分析法和其生理生化特征对其进行鉴定。结果 该菌株鉴定为克雷伯氏菌属(Klebsiella sp.)，命名为Klebsiella sp.J2（登录号为AY989899），菌株J2能以氯氰菊酯为唯一碳源进行生长，降解氯氰菊酯的最适温度是35 ℃,最佳pH是7.0。结论 菌株J2是一株能高效降解氯氰菊酯的菌株。
【关键词】 氯氰菊酯；克雷伯氏菌；生物降解
Abstract:Objective To isolate a bacterial strain J2 capable of degrading cypermethrin from sludge of a pesticide manufacturer.Methods Adopting selective culture to screen and isolate the cypermethrindegrading strain from the samples and identifying the strain by using the 16S rDNA sequence analysis and its taxonomic characteristics. Results This bacterial strain was identified as Klebsiella sp. named J2.It could grow with cypermethrin as sole source of carbon .The optimal temperature and pH of cypermethrin degradation by the organism were 35 ℃ and 7.0.Conclusion The bacterial strain J2 effectively degrade cypermethrin.
Key words:cypermethrin；Klebsiella sp. J2；biodegradation
随着20世纪80年代无机盐农药和有机氯农药的相继禁用，菊酯类农药已发展为我国现阶段使用最广泛的农药之一，由于具有广谱、内吸、触杀等高效杀虫特性，因此广受农业生产者欢迎。但是，大量使用引起的农药残留不仅造成环境与食品的污染，而且影响农产品的质量及人们的身体健康。农药残留及其废水的降解主要有微生物降解、化学降解和光降解等方式。与其他的降解方式相比，微生物降解具有操作简单、降解彻底、无二次污染等优点。因此利用微生物技术处理农药残留，并对受污染的土壤与水体进行生物修复是一种行之有效的方法。目前对有机磷和有机氯等农药的微生物降解的研究比较多，而关于菊酯类农药的降解研究较少。本文从农药厂的污泥中采集土壤样品，筛选分离到一株能高效降解氯氰菊酯的菌株（J2），并对其进行筛选、鉴定及降解性能的初步研究［13］。
1材料与方法
1.1培养基
富集培养基（1 L）：蛋白胨10 g、NaCl 2.0 g、KH2PO4 1.5 g、葡萄糖1.0 g、dH2O 1 000 mL，pH值7.0；经115 ℃，灭菌20 min。基本培养基（1 L）：NH4Cl 1.0 g，KH2PO4 0.5 g，K2HPO4 1.5 g，MgSO4 0.2 g，NaCl 0.5 g ，加入氯氰菊酯作为唯一碳源，浓度视需要添加。LB液体培养基（1 L）：蛋白胨 10 g， 酵母提取物 5 g， NaCl 5 g，pH值7.0（固体加2%的琼脂粉）。
1.2实验试剂
氯氰菊酯（质量分数95%）原药和标准品（质量分数99.9 %，色谱纯）购自成都化学试剂公司；Taq DNA聚合酶与各种限制性内切酶均购自大连宝生物；3S DNA Gel Purification kit V3.1 购自上海申能博彩生物科技有限公司；PCR引物由上海博亚合成；pMD18T载体试剂盒购自大连宝生物。
1.3降解菌株的富集和分离
将采集的农药污染土样配制成15%的悬浮液，以5%的接种量接到含25 mg/L氯氰菊酯的富集培养基中，并加适量玻璃珠，37 ℃、160 r/min振荡培养。待菌长出后，取1 mL菌液接入同样培养基中37 ℃培养，传代过程中氯氰菊酯的浓度逐步增高至300 mg/L,大约2 d传代1次。将富集的农药降解菌菌液用无菌水作10倍梯度（10-1、10-2、10-3、10-4、 10-5 、10-6）稀释，分别取0.2 mL悬液涂布在含有50 mg/L氯氰菊酯的无机盐固体培养基上，37 ℃培养；当平板出现菌落时，将单菌落在无机盐农药平板上划线分离、纯化菌株。将生长快、菌落规则、传代稳定的单菌落斜面保存。将初筛纯化的斜面单菌落接入含有50 mg/L氯氰菊酯的无机盐液体培养基,37 ℃、160 r/min培养2 d，测定其降解率。
1.4菌株的鉴定
菌株的形态及生理生化特性参照文献［4,5］进行，并采用bioMerieux Vitek全自动微生物分析系统进行鉴定，菌株16S rDNA的克隆及序列测定和比较参照文献［6］，提取J2的基因组DNA作为模板，进行菌株J2的16S rDNA扩增，PCR引物分别为：引物1：5’AGACTTTGATCCTGGCTCAG—3’； 引物2：5’CGGCTACCTTGTTACGACTTC3’； 25 μL的体系为：模板DNA 1 μL，25 mmol/L dNTP 1 μL，上、下游引物各1 μL，10×扩增缓冲液（含Mg2+）2.5μL，Taq酶（5U/μL）0.51μL，ddH2O 18 μL。PCR反应条件：94 ℃ 5 min ；94 ℃ 30 s ，52 ℃ 30 s ，72 ℃ 90 s，循环30次；72 ℃ 延伸8 min。用PCR回收试剂盒回收16S rDNA片段并连接到T载体上，转化到大肠杆菌DH5α，进行蓝白斑筛选；挑选白斑菌落进行插入片段的酶切验证；测序由上海博亚公司完成。测序结果在NCBI网站上通过blastn软件与GeneBank中的16S rDNA序列进行同源性分析比较。
1.5氯氰菊酯含量的测定［7-9］
采用气相色谱法，取培养液3 mL，移入10 mL具塞刻度试管，分别加入5 mL的石油醚，剧烈震荡10 min，静置2 h，重复2次，取上层有机相加入无水硫酸钠吸水，并定容，再用气相色谱仪（VARIAN CP3800）检测。检测条件：检测器为FID，柱HP5（30 m×0.25 mm×0.25μm），柱温采用程序升温，起始温度150 ℃，以30 ℃/min升温至250 ℃，保持15 min，载气为氮气（体积分数99.999%）,流量为40 mL/min，进样量为0.8 μL,FID检测器温度290 ℃，进样口温度260 ℃，分流比为50。氯氰菊酯的降解率按下式计算：降解率=对照样品残留量－处理样品残留量 对照样品残留量其中，对照为不接降解菌或不加降解酶的同样反应体系。
1.6菌株培养
从 4 ℃保存的J2菌株斜面接一环于LB液体培养基，37 ℃摇床培养10 h左右，以此为种子液（OD600控制在1.5左右，下同）。菌体生长量的测定：准确量取10 mL培养菌液于已称重的EP管中,4 ℃,10 000 r/min离心10 min,用无菌dH2O洗涤2次,小心去上清,所得的菌体在85 ℃烘烤箱中烘至恒重，电子分析天平称重。
2结 果
2.1高效降解菌的分离和筛选
采集样品3份，经富集和驯化，将样品稀释后涂布于选择性培养基平板上进行分离，选择平板上共筛选到7株细菌。将这7株细菌分别接种于含有50 mg/L氯氰菊酯的无机盐液体培养基中,37 ℃培养24 h后，测定氯氰菊酯的降解率，其中菌株J2对氯氰菊酯的降解率最高(94.2%),见表1。
表1分离的细菌菌株对氯氰菊酯的降解率 略
2.2高效降解菌株的初步鉴定
该降解菌株属革兰阴性菌，兼性厌氧菌，呈球杆状，单个或短链状排列，长0.9～1.2 μm, 宽2.1～2.5 μm，不形成芽孢，有荚膜。在LB培养基培养12 h的菌落直径为0.5 mm，呈半球形，半透明，湿润，表面光滑；能利用柠檬酸盐和葡萄糖作为唯一碳源，氨作为氮源；发酵葡萄糖产酸产气；甲基红实验呈阴性；VP反应显阳性；三糖铁琼脂试验不产生H2S；其他生理生化特性见表2。
2.3菌株16S rDNA的序列分析
以菌株J2的基因组DNA为模板，利用细菌16S rDNA通用引物进行PCR扩增，得到长度为1 514 bp的扩增产物（见图1），测序后在GenBank上登录，登录号为AY989899。根据同源性比较，菌株J2与Genebank中的Klebsiella pneumoniae strain 2 (登录号为DQ444287.1)和Klebsiella pneumoniae strain mcp11 d(登录号为EF419182.1) 的同源性为99%。因此根据以上形态特征和生理生化特性,参照《伯杰氏细菌鉴定手册》(第8版)［10］以及16S rDNA序列同源性比较结果,将菌株鉴定为克雷伯氏菌属(Klebsiella sp.),命名为Klebsiella sp.J2。
表2分离株J2的部分生理生化特性 略
图1菌株J2的16S rDNA 略
2.4氯氰菊酯浓度对菌株Klebsiella sp.J2的生长和降解效能的影响
在无机盐培养基中加入氯氰菊酯，使其终浓度分别为50、100、150、200、250、300、350、400 mg/L。按种子培养液2%的接种量接种，每个处理重复3次,37 ℃下160 r/min培养2 d，取样10 mL测定菌体生物量和氯氰菊酯的降解率，结果见图2。从图2可知，当氯氰菊酯浓度低于200 mg/L时，菌株Klebsiella sp.J2可以对氯氰菊酯进行降解；同时，随着氯氰菊酯浓度的提高，其生长也逐步提高，在200 mg/L时达到最大值；而当氯氰菊酯浓度超过250 mg/L时，菌株Klebsiella sp.J2细胞由于受到氯氰菊酯毒性的作用，菌体的生长受到抑制，因此，菌株的生长和对氯氰菊酯的降解随之下降，到400 mg/L时基本不能生长，降解率也趋于零。
图2氯氰菊酯浓度对菌株Klebsiella sp.J2的生长和降解效能的影响 略
2.5温度对菌株Klebsiella sp.J2的生长和降解效能的影响
按种子培养液2 %的接种量接种于内含100 mg/L氯氰菊酯的无机盐培养基中,分别在15、20、25、30、35、40、45、50、55、60 ℃下160 r/min培养2 d,每个处理重复３次，分别取样10 mL，测定菌体生物量和氯氰菊酯的降解率，结果见图3。从图3可知，在25～45 ℃之间，菌株Klebsiella sp.J2生长和降解氯氰菊酯的效果较好，其中以35 ℃时最佳，氯氰菊酯降解率达95.21 %；在25 ℃以下及45 ℃以上时，菌体生长较慢，氯氰菊酯降解率有不同程度的下降。
图3温度对菌株Klebsiella sp.J2的生长和降解效能的影响 略
2.6 pH对菌株Klebsiella sp.J2的生长和降解效能的影响
测定pH在5.0-10.0之间对菌株降解率的影响。分别配制pH值为4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、10.0的磷酸氢二钠柠檬酸缓冲液和甘氨酸氢氧化钠缓冲液，加入NaNO3、KCl灭菌，冷却后合并，分开灭菌的CaCl2、MgSO4·7H2O，使用前加入100 mg/L的氯氰菊酯。按种子培养液2%的接种量接种，每个处理重复３次,37℃下160 r/min培养2 d后，取样10 mL测定菌体生物量和氯氰菊酯的降解率，结果见图4。从图4可知，在pH 5.5-7.5之间，菌株Klebsiella sp.J2的生长和降解效能比较好，最适pH为7.0，降解率为96.11%。
图4pH对菌株Klebsiella sp.J2的生长和降解效能的影响 略
2.7菌株Klebsiella sp.J2的降解底物谱研究
按种子培养液2%的接种量接种于含100 mg/L不同菊酯类农药和1 %葡萄糖的无机盐培养基中,于37 ℃下160 r/min培养2 d后,取样10 mL测定菌体生物量和不同菊酯类农药的降解率，结果见表3。从表3可知, 菌株Klebsiella sp.J2对各种菊酯类农药都有比较好的降解能力,特别是对氯氰菊酯、甲氰菊酯的降解作用非常明显,而对氰戊菊酯、溴氰菊酯、联苯菊酯的降解作用则不明显。
表3菌株Klebsiella sp.J2的降解底物谱研究 略
3结 论
通过富集培养从农药厂的污泥中分离到一株能以氯氰菊酯为唯一碳源生长且能将其高效降解的细菌，经生理生化试验及16S rDNA初步鉴定为克雷伯氏菌属(Klebsiella sp.),命名为Klebsiella sp.J2;对降解菌Klebsiella sp.J2的生长和降解条件进行了初步的研究，该菌株降解氯氰菊酯的最适温度是35 ℃,最佳pH是7.0;降解菌Klebsiella sp.J2还能降解甲氰菊酯、氰戊菊酯、溴氰菊酯、联苯菊酯等多种菊酯类农药。
4讨 论
为了分离特定农药的降解菌，富集时以这种农药为唯一碳源和能源，只添加必要的无机盐，在特定生长条件下（即在某一选择压力下）长期培养微生物，在此条件下生长并且占优势的微生物一定能够分解利用此条件中的营养物质。按照这一原理设计富集培养基，从长期受菊酯农药污染的土壤中采集样品，以此富集培养基连续富集驯化，在此培养基中生长的微生物即能利用氯氰菊酯作为碳源进行生长，并在培养环境中占据优势。
本文初步分析了不同的外界条件对菌株的降解效能的影响。结果表明，菌株对这些条件都有一个适宜的适应范围，在此范围内具有较好的降解力，超出了这个范围，菌株的降解效能就受到影响。不同的条件具有不同的效果，这可能是由菌株的生理结构及特性所决定的。因此在降解菌的开发利用过程中，应该综合考虑到这些因素的影响，并合理利用，以充分发挥菌株的降解效能。
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