| 致谢 | 第11-13页 |
| 缩略表 | 第13-15页 |
| 摘要 | 第15-17页 |
| Abstract | 第17-19页 |
| 1 引言 | 第20-29页 |
| 1.1 植物磷吸收转运调控机制 | 第20-21页 |
| 1.2 植物磷酸盐转运体PHT1家族的发现及其基本特征 | 第21页 |
| 1.3 PHT1转运体的四级调控模型 | 第21-28页 |
| 1.3.1 PHT1基因的转录调控 | 第22-23页 |
| 1.3.2 PHT1逃逸内质网机制 | 第23-25页 |
| 1.3.3 PHT1从内质网到质膜的内膜运输 | 第25-27页 |
| 1.3.4 PHT1蛋白在细胞质膜上的稳定机制 | 第27-28页 |
| 1.4 本研究目标 | 第28-29页 |
| 2 磷吸收突变体的筛选及表型分析 | 第29-38页 |
| 2.1 材料与方法 | 第29-33页 |
| 2.1.1 抗砷试验和突变体筛选 | 第29-30页 |
| 2.1.2 突变体株型观察及有效磷分析 | 第30页 |
| 2.1.3 F_2群体的创建及遗传分析 | 第30-31页 |
| 2.1.4 基因克隆与测序分析 | 第31页 |
| 2.1.5 转基因互补实验 | 第31-32页 |
| 2.1.6 OsPHF1的蛋白序列及结构分析 | 第32-33页 |
| 2.2 结果与分析 | 第33-38页 |
| 2.2.1 phf1突变体表型及PHF1基因克隆 | 第33-38页 |
| 3 PHF1功能分析 | 第38-50页 |
| 3.1 材料与方法 | 第38-43页 |
| 3.1.1 OsPHF1基因表达水平的调控 | 第38-39页 |
| 3.1.2 35S-OsPHF1-sGFP融合蛋白在植物细胞内的亚细胞定位分析 | 第39页 |
| 3.1.3 OsPHF1/phf1蛋白与OsPT蛋白互作分析 | 第39-41页 |
| 3.1.4 OsPT-GFP蛋白在水稻原生质体内的亚细胞定位分析 | 第41-42页 |
| 3.1.5 OsPHF1的超表达转基因实验 | 第42页 |
| 3.1.6 OsPHF1磷信号响应表达分析 | 第42-43页 |
| 3.2 结果与讨论 | 第43-50页 |
| 3.2.1 OsPHF1的组织表达方式 | 第43-44页 |
| 3.2.2 OsPHF1蛋白亚细胞的定位 | 第44-45页 |
| 3.2.3 OsPHF1与磷酸转运体蛋白(OsPT)互作分析 | 第45-46页 |
| 3.2.4 OsPHF1调控OsPT细胞质膜定位 | 第46页 |
| 3.2.5 OsPHF1超表达导致有效磷积累 | 第46-48页 |
| 3.2.6 OsPHF1功能缺失抑制OsPHR2介导的磷超积累 | 第48-50页 |
| 4 磷转运体蛋白互作激酶筛选及互作研究 | 第50-60页 |
| 4.1 材料与方法 | 第50-55页 |
| 4.1.1 膜酵母双杂筛库 | 第50-51页 |
| 4.1.2 核酵母双杂分析 | 第51-52页 |
| 4.1.3 Pull-down实验方法 | 第52-53页 |
| 4.1.4 酵母三杂实验 | 第53-55页 |
| 4.1.5 co-IP实验 | 第55页 |
| 4.2 结果与讨论 | 第55-60页 |
| 4.2.1 膜酵母双杂筛库结果 | 第55-56页 |
| 4.2.2 CK2四个亚基形成四聚体 | 第56-57页 |
| 4.2.3 CK2β3与OsPT结合并介导CK2α3与OsPT结合 | 第57-60页 |
| 5 CK2α3/β3磷酸化PT | 第60-70页 |
| 5.1 材料与方法 | 第60-63页 |
| 5.1.1 CK2亚基-GFP融合载体构建 | 第60-61页 |
| 5.1.2 OsPT模拟非磷酸化(PT8~(S517A))突变融合GFP载体构建 | 第61-62页 |
| 5.1.3 CK2α3/β3的亚细胞定位 | 第62页 |
| 5.1.4 体外磷酸化分析 | 第62-63页 |
| 5.1.5 体内磷酸化分析 | 第63页 |
| 5.2 结果与讨论 | 第63-70页 |
| 5.2.1 α3/β3亚基参与OsPT从ER到PM的转运 | 第63-65页 |
| 5.2.2 α3/β3定位于ER与早期内膜运输途径 | 第65-67页 |
| 5.2.3 α3体外磷酸化OsPT | 第67-70页 |
| 6 PHF1与α3/β3协同调控PT膜定位机制 | 第70-76页 |
| 6.1 材料与方法 | 第70-71页 |
| 6.2 结果与讨论 | 第71-76页 |
| 6.2.1 超表达PHF1不改变模拟磷酸化PT的ER定位 | 第71-72页 |
| 6.2.2 磷酸化阻碍PHF1与PT结合 | 第72-74页 |
| 6.2.3 抑制α3不能恢复phf1-1突变体表型与磷吸收能力 | 第74页 |
| 6.2.4 细胞内磷浓度影响PT磷酸化状态 | 第74-76页 |
| 7 CK2亚基对植株磷吸收影响 | 第76-85页 |
| 7.1 材料与方法 | 第76-78页 |
| 7.1.1 CK2α2,CK2β1历突变体鉴定 | 第76-77页 |
| 7.1.2 CK2α3,CK2β3干涉转基因材料发展 | 第77-78页 |
| 7.1.3 CK2α3,CK2β3超表达转基因材料发展 | 第78页 |
| 7.1.4 水稻溶液培养方法及植物有效磷(Pi)分析方法 | 第78页 |
| 7.1.5 植株~(33)P吸收分析 | 第78页 |
| 7.2 结果与讨论 | 第78-85页 |
| 7.2.1 α2/β1突变体生理与表型分析 | 第78页 |
| 7.2.2 α3与β3干涉转基因植株分析 | 第78-82页 |
| 7.2.3 α3与β3超表达转基因植株分析 | 第82-83页 |
| 7.2.4 PHF1与CK2α3/β3共同调控PT膜定位模型 | 第83-85页 |
| 8 结论与展望 | 第85-88页 |
| 9 参考文献 | 第88-97页 |
| 10 攻读博士期间发表的论文 | 第97-98页 |
| 11 附录试验方法及补充数据 | 第98-133页 |
| 11.1 植株有效磷分析 | 第98-99页 |
| 11.2 水稻DNA的小量提取(SDS法抽提植物基因组DNA) | 第99-100页 |
| 11.3 电转化农杆菌感受态细胞的制备及电击法转化农杆菌 | 第100-101页 |
| 11.4 水稻成熟胚愈伤组织制备和转基因步骤 | 第101-103页 |
| 11.4.1 以水稻成熟胚为试材诱导愈伤组织 | 第101-102页 |
| 11.4.2 共培养和抗性愈伤组织的选择 | 第102页 |
| 11.4.3 抗性愈伤组织的诱导分化和生根 | 第102页 |
| 11.4.4 转基因苗的锻炼和移栽 | 第102-103页 |
| 11.5 水稻DNA的大量提取 | 第103-104页 |
| 11.6 SOUTHERN印迹转移 | 第104-105页 |
| 11.7 植物总RNA提取,逆转录及半定量RT-PCR | 第105-107页 |
| 11.7.1 植物总RNA提取 | 第105-106页 |
| 11.7.2 逆转录及半定量RT-PCR | 第106-107页 |
| 11.8 GUS染色及显微观察 | 第107-109页 |
| 11.9 质粒大量制备及基因枪法转化洋葱表皮细胞 | 第109-112页 |
| 11.9.1 大肠杆菌质粒大量制备(用QIAGEN Maxi Column) | 第109-110页 |
| 11.9.2 基因枪法转化洋葱表皮细胞 | 第110-112页 |
| 11.10 悬浮细胞培养及原生质体转化方法 | 第112-114页 |
| 11.10.1 悬浮细胞的培养 | 第112-114页 |
| 11.11 酵母感受态细胞的制备及转化 | 第114-115页 |
| 11.11.1 感受态的制备 | 第114页 |
| 11.11.2 酵母感受态的转化 | 第114-115页 |
| 11.12 荧光定量RT-PCR操作流程 | 第115-120页 |
| 11.12.1 荧光定量PCR工作原理 | 第115-116页 |
| 11.12.2 试剂及qRT-PCR体系和程序 | 第116-117页 |
| 11.12.3 定量RT-PCR具体操作 | 第117-118页 |
| 11.12.4 数据分析 | 第118-119页 |
| 11.12.5 注意事项 | 第119-120页 |
| 11.13 膜酵母双杂筛库 | 第120-122页 |
| 11.13.1 筛库用诱饵载体构建及表达鉴定 | 第120-122页 |
| 11.14 PULLDOWN、CO-IP蛋白互作试验 | 第122-126页 |
| 11.14.1 原核蛋白提取 | 第122页 |
| 11.14.2 烟草蛋白提取 | 第122-123页 |
| 11.14.3 Pull-down实验 | 第123-124页 |
| 11.14.4 co-IP实验 | 第124-126页 |
| 11.15 体外磷酸化试验 | 第126-128页 |
| 11.16 植物细胞膜蛋白分离方法 | 第128-131页 |
| 11.16.1 高密度提取液(EB)配制 | 第128-129页 |
| 11.16.2 收集并匀浆植物组织 | 第129页 |
| 11.16.3 制备澄清的匀浆物 | 第129-130页 |
| 11.16.4 通过台式高速离心机收集膜蛋白 | 第130页 |
| 11.16.5 膜蛋白利率及检测 | 第130-131页 |
| 11.17 韩国PFG T-DNA插入突变体的鉴定 | 第131-132页 |
| 11.18 P~(33)吸收动力学实验 | 第132-133页 |
| 11.18.1 准备工作 | 第132-133页 |
| 11.18.2 实验阶段 | 第133页 |
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