| 中文摘要 | 第3-5页 |
| Abstract | 第5-6页 |
| 符号说明 | 第11-12页 |
| 文献综述 | 第12-25页 |
| 1. 溶血素的表达与调控 | 第12-13页 |
| 1.1 溶血素操纵子 | 第12页 |
| 1.2 基因的调控 | 第12-13页 |
| 2. HlyA的加工与分泌 | 第13-14页 |
| 2.1 HlyC的酰化作用 | 第13页 |
| 2.2 Ⅰ型分泌系统 | 第13-14页 |
| 3. HlyA的运输形式 | 第14-16页 |
| 4. Hly与其他毒力因子的相互作用 | 第16-17页 |
| 5. HlyA与宿主细胞的相互作用 | 第17-20页 |
| 5.1 细胞脱落作用 | 第17-18页 |
| 5.2 宿主的炎性反应 | 第18页 |
| 5.3 促凋亡作用 | 第18-19页 |
| 5.4 促吞噬作用 | 第19页 |
| 5.5 促氧化作用 | 第19-20页 |
| 参考文献 | 第20-25页 |
| 研究一 ETEC大肠杆菌溶血素HlyA的原核表达、纯化及多克隆抗体的制备 | 第25-40页 |
| 1. 材料 | 第26-27页 |
| 1.1 菌株、质粒 | 第26页 |
| 1.2 培养基和主要试剂 | 第26页 |
| 1.3 实验动物 | 第26页 |
| 1.4 主要仪器 | 第26-27页 |
| 2. 方法 | 第27-33页 |
| 2.1 引物设计及合成 | 第27页 |
| 2.2 PCR扩增目的基因 | 第27-28页 |
| 2.2.1 PCR模板的制备 | 第27页 |
| 2.2.2 PCR反应体系与程序 | 第27-28页 |
| 2.3 PCR产物纯化与回收 | 第28页 |
| 2.4 氯化钙法制备DH5口感受态细胞 | 第28页 |
| 2.5 连接与转化 | 第28-29页 |
| 2.5.1 克隆片段与T载体连接 | 第28-29页 |
| 2.5.2 连接片段导入感受态细胞 | 第29页 |
| 2.6 阳性克隆的筛选与鉴定 | 第29-30页 |
| 2.6.1 碱裂解法小提质粒 | 第29页 |
| 2.6.2 鉴定及测序 | 第29-30页 |
| 2.7 重组原核表达质粒的构建与鉴定 | 第30-31页 |
| 2.7.1 酶切与连接 | 第30页 |
| 2.7.2 电转化感受态细胞的制备 | 第30页 |
| 2.7.3 电转化 | 第30页 |
| 2.7.4 鉴定及测序 | 第30-31页 |
| 2.8 HlyA在pET-28a(+)载体中的原核表达 | 第31-32页 |
| 2.8.1 HlyA重组蛋白的表达条件分析 | 第31页 |
| 2.8.2 HlyA重组蛋白的表达及表达形式分析 | 第31-32页 |
| 2.9 HlyA重组蛋白的变性、纯化、复性与浓缩 | 第32页 |
| 2.10 HlyA重组蛋白Western-blot鉴定 | 第32页 |
| 2.11 HlyA重组蛋白兔源多抗血清的制备与鉴定 | 第32-33页 |
| 2.11.1 动物免疫 | 第32-33页 |
| 2.11.1.1 弗氏佐剂免疫 | 第32页 |
| 2.11.1.2 QuickAntibody快速佐剂免疫 | 第32-33页 |
| 2.11.2 ELISA测定血清效价 | 第33页 |
| 2.11.3 HlyA重组蛋白兔源多抗的Western-blot检测 | 第33页 |
| 2.11.4 HlyA重组蛋白兔源多抗血清的采集分离 | 第33页 |
| 3. 结果 | 第33-38页 |
| 3.1 hlyCA的PCR产物鉴定 | 第33-34页 |
| 3.2 重组表达质粒pET-28a-hlyCA鉴定及其单双酶切鉴定 | 第34-35页 |
| 3.3 HlyA重组蛋白的诱导条件和表达形式分析 | 第35-37页 |
| 3.4 HlyA重组蛋白的纯化与Western blot鉴定 | 第37-38页 |
| 3.5 重组蛋白HlyA兔源多克隆抗体的制备及鉴定 | 第38页 |
| 4. 讨论 | 第38-40页 |
| 研究二 ETEC溶血素HlyA的生物学功能研究 | 第40-58页 |
| 1. 材料 | 第41-42页 |
| 1.1 菌株、细胞 | 第41-42页 |
| 1.2 培养基和主要试剂 | 第42页 |
| 1.3 主要仪器 | 第42页 |
| 2. 方法 | 第42-47页 |
| 2.1 qRT-PCR检测野生株、突变株和回补株中相关基因表达量变化 | 第42-45页 |
| 2.1.1 设计引物 | 第42-43页 |
| 2.1.2 Trizol法RNA抽提 | 第43页 |
| 2.1.3 cDNA的合成 | 第43-44页 |
| 2.1.4 PCR鉴定cDNA | 第44页 |
| 2.1.5 qRT-PCR反应 | 第44-45页 |
| 2.2 溶血素表达形式的鉴定 | 第45页 |
| 2.2.1 外膜囊泡及溶血素的分离 | 第45页 |
| 2.2.2 外膜囊泡及溶血素的Western blot鉴定 | 第45页 |
| 2.3 IPEC-J2细胞的体外粘附试验 | 第45-46页 |
| 2.3.1 IPEC-J2细胞的培养与传代 | 第46页 |
| 2.3.2 IPEC-J2细胞的黏附试验 | 第46页 |
| 2.3.3 IPEC-J2细胞的黏附抑制试验 | 第46页 |
| 2.3.4 IPEC-J2细胞的血清黏附抑制试验 | 第46页 |
| 2.4 IPEC-J2细胞形态学变化观察 | 第46-47页 |
| 2.5 IPEC-J2细胞毒性试验 | 第47页 |
| 3. 结果 | 第47-55页 |
| 3.1 荧光定量PCR检测hlyA基因缺失对其它毒力因子的影响 | 第47-48页 |
| 3.2 溶血素表达形式的鉴定 | 第48-49页 |
| 3.3 IPEC-J2细胞的黏附试验和黏附抑制试验 | 第49-52页 |
| 3.3.1 IPEC-J2细胞的黏附试验 | 第49-50页 |
| 3.3.2 IPEC-J2细胞的黏附抑制试验 | 第50-51页 |
| 3.3.3 IPEC-J2细胞的血清黏附抑制试验 | 第51-52页 |
| 3.4 HlyA对IPEC-J2细胞形态的影响 | 第52-54页 |
| 3.5 HlyA对IPEC-J2细胞的细胞毒性试验 | 第54-55页 |
| 4. 讨论 | 第55-58页 |
| 4.1 荧光定量PCR检测hlyA基因缺失对其它毒力因子的影响 | 第55页 |
| 4.2 溶血素表达形式的鉴定 | 第55-56页 |
| 4.3 IPEC-J2细胞黏附试验和黏附抑制试验 | 第56-58页 |
| 参考文献 | 第58-59页 |
| 全文总结 | 第59-60页 |
| 致谢 | 第60-61页 |
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