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人乙醇脱氢酶原核表达载体构建及产物活性测定
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【中医学生毕业论文】 作者：钱晓伟，潘丹岷，谭湘陵【摘要】 目的：构建人乙醇脱氢酶(alcohol dehydrogenase, ADH)原核表达载体，在表达菌BL21中进行体外原核表达并测定ADH蛋白的酶学性质。方法：用RT-PCR技术从人肝RNA中克隆ADH开放阅读框架序列，并与表达载体pET-5a连接、转化入宿主菌BL21中，并经培养、筛选、酶切和测序鉴定。用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达菌并测定表达蛋白的酶学参数。结果：原核表达载体pET-5a-ADH构建成功；表达蛋白分子量在40kD左右；酶学测定表明表达蛋白是一种耐酸、耐高温的脱氢酶，钾离子和三价铁离子对其酶活性有促进作用，二价金属离子对其活性有抑制作用。结论：人ADH原核表达载体pET-5a-ADH成功构建，原核表达产物具有一定的ADH蛋白活性。该研究为进一步了解ADH酶学性质，探讨酶活性多态性与疾病的关系打下基础。
【关键词】 乙醇脱氢酶；原核表达；酶活性；人
[Abstract] Objective: To construct the prokaryotic expression vector of the human alcohol dehydrogenase(ADH), get the prokaryotic product in vivo, and detect its enzymic property. Methods: The sequence of open reading frame(ORF) of human ADH was cloned by RT-PCR from human liver RNA. Then it was linked to the expression vector pET-5a, and the vector was transformed into host bacterium of BL21. Then, culturing, screening, cutting by restriction enzyme and sequencing were performed for identification. IPTG was used to induce expression in BL21, and some enzymic indexes of expressed proteins were detected. Results: The prokaryotic expression vector was constructed successfully, and the molecular weight of expressed protein was around 40 KD. The prokaryotic product had a great tolerance in acid and high temperature environment. K+ and Fe3+ had a stimulative effect on enzymic activity, but divalent metal ion had a restrain effect. Conclusions: The human ADH prokaryotic expression vector is successfully constructed, and the ADH protein from prokaryotic expression has activity. The present study provides experimental data to understand ADH enzymic property, and to explore the relationship between polymorphism of ADH activity and disease.
[Key words] Alcohol dehydrogenase; Prokaryotic expression; Enzyme activity; Human
乙醇脱氢酶(alcohol dehydrogenase，ADH)和乙醛脱氢酶(aldehyde dehydrogenase，ALDH)是乙醇代谢中的关键酶。ADH催化乙醇转化为乙醛，然后ALDH把乙醛转化为乙酸，乙酸又经三羧酸循环途径，最终转化为二氧化碳和水排出体外。研究发现，ADH和ALDH都是多个同工酶组成的大家族。人类ADH基因位于4q21-25，可编码同源或异源二聚体的ADH同工酶。目前已发现了7种亚型，分别为ADH1A、ADH1B、ADH1C、ADH4、ADH5、ADH6 和ADH7，这些基因在人群中存在着广泛的多态性[1]。ADH是一种含锌的金属酶，其同工酶有20余种，常见ADH的亚基类型有5种，分别为α、β、 χ、 γ和π[2]。
由于ADH存在着多态现象，因此乙醇代谢能力在人群中也存在着差异，不仅如此，ADH的多态性也与器官病变和疾病发生(如肝硬化、心脏病等)的易感性也相关[3]，甚至与乙醇依赖性也相关。为进一步了解ADH的酶学性质，探讨ADH与疾病的关系，本文构建了人ADH原核表达载体，进行了体外表达，并测定了部分酶学参数。
1 材料和方法
1.1 材料与试剂 人肝脏标本来自于肝癌患者手术切除的癌旁正常组织。Trizol、逆转录试剂盒、限制性内切酶、Taq DNA聚合酶等购自TaKaRa公司，NAD+氧化型辅酶Ⅰ购自上海捷瑞公司。
1.2 方法
1.2.1 原核表达载体pET-5a-ADH的构建 根据Trizol说明书提取人肝总RNA，并逆转录形成cDNA。根据人ADH(GenBank 登录号：AF153821)序列和原核表达载体pET-5a多克隆位点的内切酶分布，设计了一对带有Bam HI和EcoR I酶切位点引物，引物序列分别为：
5'-CGGGATCCATGAGCACAGCAGGAAAAGTA；
5'-CGGAATTCGCATCTCTATTGCCTCAAAAC(下划线部分为酶切位点)。
根据上述引物，预计扩增的PCR产物的长度为1158 bp。以逆转录cDNA为模板进行PCR扩增，条件为： 94 ℃ 5 min、94 ℃ 45 s、52 ℃ 45 s、72 ℃ 45 s、72 ℃ 7 min；循环35次。
将PCR扩增产物和原核表达载体pET-5a分别用Bam HI和EcoR I进行酶切后连接，将连接产物转化入表达菌BL21中，涂皿。20 h后挑取平皿生长的菌落，LB液体扩大培养，提取质粒，采用PCR进行阳性克隆筛选、并进行双酶切和测序鉴定。
1.2.2 重组蛋白的诱导表达 用含氨苄青霉素（100 μg/ml）的LB液培养阳性菌，在OD600为0.6时加入诱导剂异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG），使其终浓度为0.6 mmol/L，37 ℃诱导培养7 h，以不加IPTG的菌为对照组。以煮沸裂解法破菌，对全菌蛋白进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，检测重组蛋白的表达情况。
1.2.3 ADH酶学动力学研究 辅酶NAD存在NADH和NAD+两种形式，它们分别在340 nm和260 nm处有最大吸收峰，因此对于以NAD+为辅酶的各种脱氢酶类，均可通过测定光吸收值在340 nm处的变化，来定量测定反应中的酶活性。
1.2.3.1 温度对酶活性的影响 将1份NAD+溶液与5份pH7.0的磷酸二氢钠－磷酸氢二钠缓冲液混合配成基质液备用[4]。于测定管中加入30 μl实验组酶液，对照管中加入30 μl对照组酶液，再分别加入基质液600 μl，混匀后置37 ℃水浴1 min，然后分别向测定管和对照管中加入12 μl乙醇溶液，轻轻摇匀，分别置于不同的温度( 30 ℃、37℃、45 ℃、50 ℃、55 ℃、60 ℃、70 ℃、80℃)水浴5 min，在340 nm处记录测定每管吸光度，计算出测定管每min平均吸光度(△A/min)，按下列公式算出酶的活性，绘制酶活力－温度曲线，确定酶促反应的最适温度。
ADH 活性(U/L)=△A/min×■×■×10■
=△A/min×3400
ADH的活性的国际单位(U)是以在每min内ADH催化产生1 μg NADH的酶量定义为1个国际单位。
1.2.3.2 pH对酶活性的影响 配制pH为4.0的乙酸―乙酸钠缓冲液，pH为5.0、6.0、7.0、8.0的磷酸氢二钠―磷酸二氢钠缓冲液，pH为9.0的甘氨酸―氢氧化钠缓冲液。将NAD+溶液分别与不同pH值的缓冲液按1∶5比例混合，配成基质液备用。于测定管中加入30 μl实验组酶液，对照管中加入30 μl对照组酶液，再分别加入基质液600 μl，混匀后置37 ℃水浴1min，然后分别向测定管和对照管中加入12 μl乙醇溶液，轻轻摇匀，置于37 ℃水浴5 min，在340 nm处记录测定每管吸光度。绘制酶活力―pH值曲线，确定酶的最适pH值。
1.2.3.3 金属离子对酶活性的影响 配制pH4.0的终浓度为5.0 mmol/L的不同金属盐化合物（KCl、CaCl2、MgCl2、CuCl2、ZnCl2、MnCl2和FeCl3）的缓冲液，将NAD+溶液分别与不同金属盐化合物缓冲液按1∶5比例混合，配成基质液备用。于测定管中加入600 μl的含金属盐化合物的基质液，对照管中加入不含金属盐的基质液，再分别加入30 μl实验组酶液，混匀后置37 ℃水浴1 min，然后分别向测定管和对照管中加入12 μl乙醇溶液，轻轻摇匀，置于37℃水浴5 min，在340 nm处记录测定每管吸光度。
2 结 果
2.1 人ADH开放阅读框架片段的获得 以人肝RNA为模板，用含Bam HI和EcoR I酶切位点的引物进行PCR扩增，扩增产物用1.0％琼脂糖凝胶电泳分析，产物在电泳图谱上呈现出单一清晰的条带，其片段大小约为1.1 kb，与预期产物（1158 bp)大小一致，初步证实PCR产物为人ADH开放阅读框架片段（图1）。
2.2 原核表达载体pET-5a-ADH的构建与鉴定 将实验中获得的阳性克隆扩大培养，提取质粒，PCR扩增后用1.0％琼脂糖凝胶电泳分析，结果显示提取的质粒中含有目的基因(约1000 bp处的条带)，见(图2中泳道1)，且目的基因成功亚克隆至原核表达载体中(约4000 bp)。同时将重组质粒用EcoRⅠ和BamHⅠ进行双酶切。酶切所得的产物用1.0%琼脂糖凝凝胶电泳进行分析(图3)电泳显示4 kb和1.1 kb片段，与预期产物大小一致，从而初步表明ADH片段已成功克隆至pET5a-c载体中。将重组质粒送测序，结果显示(图4)，该序列与GenBank所报道的序列完全一致，并且碱基无移码，表示原核表达载体pET-5a-ADH构建成功。
2.3 ADH的诱导表达 提取诱导表达蛋白，并通过SDS-PAGE电泳检测分析。结果如图5所示，与未诱导组相比，诱导组在40 kD处出现了一明显条带(如箭头所示)，而未诱导组该条带不明显，说明IPTG能诱导出ADH蛋白，该蛋白的分子量为40 kD左右，与文献报道相同[5]。
2.4 ADH的酶学性质
2.4.1 温度对ADH活性的影响 ADH粗酶液在不同温度下保温测定酶活性，结果如图6所示，由图可知，温度从30 ℃升高到37℃，ADH活力在增加；从37 ℃升高到45℃ , ADH活力在降低；从45 ℃升高到70℃，ADH 活力迅速上升；70℃以后，温度有下降趋势。表明体外原核表达的ADH在70℃左右具有最高活力；同时也表明此来源的ADH耐高温。
2.4.2 pH对ADH活性的影响 pH对ADH活性的影响结果见图7。从图7可以看出：在pH4.0时活力最高，随着pH的升高，其活性逐渐降低，在pH 6.0~9.0之间变化不大，表明体外原核表达的ADH是一种耐酸的脱氢酶。
2.4.3 金属离子对ADH活性的影响 见表1。
由表1可看出：K+、Fe3+对ADH酶活性有促进作用；二价金属离子对ADH有不同程度的抑制作用。
3 讨 论
乙醇中毒、乙醇依赖及其相关问题是仅次于心血管疾病、肿瘤的第三大公共卫生问题，乙醇代谢的2种酶—乙醇脱氢酶和乙醛脱氢酶，存在着明显的种族差异和个体差异[6]。研究表明，ADH和ALDH的多态性不仅与乙醇耐受相关，还与疾病的发生相关，因而受到学术界的关注。
Lizano等[7]在对人红细胞体外消耗乙醇研究的基础上，应用电穿孔技术将ADH与ALDH联合包埋于小鼠红细胞中，用于对急性乙醇中毒小鼠进行处理。结果表明，小鼠血中乙醇浓度较对照组低43%，乙醇消除量高达0.39 ml/min，较对照组高0.19 ml/min。说明包被ADH和ALDH的红细胞可以作为潜在的载体系统消除摄入体内的高浓度乙醇。
已有报道PET32a-ZNFD原核表达载体的构建[8]，本研究采用pET-5a成功构建了表达人ADH的原核质粒，并表达出具有活力的ADH蛋白。测定结果显示，该蛋白在体外的最适温度为70 ℃，说明体外原核表达的ADH蛋白具有耐高温特点，这与已经报道的血清[4]、Acetobacter Z127[9]、马肝和酵母的ADH 最适反应温度(分别为37 ℃、60 ℃、20 ℃和25 ℃)不同。测定结果还显示，体外原核表达的ADH是一种耐酸的脱氢酶，随着pH的升高，其活性逐渐降低；在pH 6.0到9.0之间变化不大。这些测定结果不同于已经报道的血清[4](最适pH为9.0)、Acetobacter Z127[9](最适pH为7.0)、马肝和酵母(最适pH为8.6～9.0)的ADH 最适pH，该ADH可以在酸性环境中催化乙醇代谢。为什么不同条件下的ADH具有不同的理化性质，还有待于进一步研究。金属离子对这种蛋白的活性也有一定的影响，K+、Fe3+对ADH酶活性有促进作用，特别是Fe3+对活性的促进作用十分明显。而二价金属离子对ADH有不同程度的抑制作用，可能是严重影响酶的构象造成活性降低。根据文献报道，Zn2+是ADH的辅助因子，在本研究中添加的Zn2+可能过量，导致对ADH的活力产生了一定的抑制效应。
【参考文献】
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[2] Gemmas，Vichis, Testai E． Individual susceptibility and alcohol effects:：biochemical and genetic aspects[J]. Ann Ist Super Sanita, 2006, 42(1): 8-16.
[3] Han CL，Liao CS，Wu CW，et al. Contribution to first-pass metabolism of ethanol and inhibition by ethanol for retinol oxidation in human alcohol dehydrogenase family. Implications for etiology of fetal alcohol syndrome and alcohol-related diseases[J]. Eur J Biochem, 1998, 254(1):25-31.
[4] 胡建强，刘凤兰． 血清乙醇脱氢酶活性测定及临床应用[J]．天津医科大学报，2001，7(1)：110-111.
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[7] Lizano C, Perez T, Pinilla M, et al. Mouse erthrocytes as carriers for coencapsulated alcohol and aldehyde dehydrogenase obtained by elect roporation in vivo surviva rate in circulation, organ distribution and ethanol degradation[J]. Life Sceinces, 2001, 68(17): 2001-2016.
[8] 史群芳，杨世蕊，雷 陈，等. 新基因ZNFD的克隆及其多克隆抗体的制备[J]. 南通大学学报（医学版），2008，28（3）：157-160，164.
[9] 霍丹群，张云茹，侯长军．Acetobacter Z127乙醇脱氢酶的纯化及酶学性质[J]． 重庆大学学报，2006，29(4)：65-68.
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