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“酚氯仿裂解法”提取质粒DNA其它医学

【##中医学院毕业论文】 作者:张林琳,李翔,张栋,贺大林,李磊,王新阳【关键词】 质粒DNA;酚氯仿;提取;内切酶;聚合酶链反应;电泳【关键词】 质粒DNA;酚氯仿;提取;内切酶;聚合酶链反应;电泳
1材料和 方法
1.1材料含有人柯萨奇腺病毒受体 (human Coxsackie and adenovirus receptor, hCAR)基因的真核表达质粒载体pIRES2EGFPhCAR由本 研究 所构建;转化菌E.coli DH5a由本研究所保存;内切酶PstI购自TaKaRa公司. LB培养基(蛋白胨10 g,酵母提取物5 g,氯化钠10 g). Tris饱和酚、氯仿按1∶1体积比配制成混合液;无水乙醇;RTE溶液: 10 mmol/L TrisHCl (pH 8.0), 1 mmol/L EDTA+20 mg/mL RNase A(无DNase). 直径35 mm可反复使用针式小滤器及0.22 μm滤膜购自华美生物生物公司.
1.2方法 ① 从琼脂平板上挑取转化菌阳性克隆,接种到标准LB培养液中(含有卡那霉素30 μg/mL)摇菌12 h;收集1.5 mL菌液,8000 g/min离心3 min,弃上清,沉淀加入200 μL TE,充分混匀;加入400 μL酚氯仿(1∶1体积)混合液,剧烈振动10 s,混匀;12 000 g/min离心5 min,1 mL胰岛素注射针收集上清,尽量避免吸入蛋白沉淀层;上清经国产0.22 μm针式滤器过滤1次;向过滤上清液内加入2倍体积无水乙醇,振荡10 s,12 000 g/min离心5 min;沉淀溶于20 μL的RTE溶液中,37℃水浴. ② 按PstI内切酶说明书进行酶切反应(37℃,1 h). 酶切产物10 μL,10 g/L琼脂糖凝胶电泳. ③ PCR引物根据 参考 文献 [1]设计,预计扩增产物片断大小为714 bp. ④ 常规制备感受态菌E.coli DH5a,提取质粒DNA常规转化感受态,涂于含有卡那霉素(30 μ/mL)LB培养平板中,37℃培养,15 h后观察筛选克隆情况.
2结果
提取质粒DNA经Pst I酶切能获得1.17 kb的目的片断(图1). 以提取质粒DNA为模版,进行目的基因hCAR的PCR,可以获得714 bp产物片断,与预期大小一致(图2). 提取质粒DNA常规转化感受态细菌,能获得较多的阳性克隆.
M: maker;1: 未酶切质粒,星号所示为超螺旋结构的质粒DNA;2: 经PstI酶切质粒片断.
图1质粒酶切片断的电泳结果(略)
M: marker;1~2: PCR产物.
图2PCR电泳(略)
3讨论
目前 常用的质粒提取 方法 是在“碱裂解法”[2]基础上优化和改进形成. “碱裂解法”所需溶液试剂比较多,配制过程繁琐. “酚氯仿裂解法”[3]利用酚氯仿混合有机溶剂破碎细菌,使菌体蛋白质变性析出,细菌核酸、质粒DNA经无水乙醇沉淀后,用RNase A降解RNA,细菌基因组DNA和质粒DNA被提取出. 由于该方法质粒DNA未经变性复性过程,三级结构保持较完整,所以提取的质粒DNA以超螺旋结构为主. 本方法提取的质粒DNA中含有细菌基因组DNA, 影响 提取质粒DNA的准确定量,但这并不影响下一步的实验,如酶切、转化、亚克隆以及聚和酶链反应等基本分子生物学实验.
【 参考 文献 】
[1] Lai YJ, Pong RC, McConnell JD, et al. Surrogate marker for predicting the virus binding of urogenital cancer cells during adenovirusbased gene therapy [J]. Biotechniques, 2003,35(1):186-190,192-194.
[2] Sambrook J, Fritsch EF, Maniatis T. Molecular cloning: A laboratory manual, 3nd ed [M]. Cold Spring Harbor, NY:Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001:16-19.
[3] Song J, Geltinger C, Sun K, et al. Direct lysis method for the rapid preparation of plasmid DNA [J]. Anal Biochem,1999,271(1):89-91.

 
 
 
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