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当前位置:教育论文中心首页--博士论文--人的类硫氧化还原蛋白基因全长cDNA的克隆、鉴定和初步的功能研究
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人的类硫氧化还原蛋白基因全长cDNA的克隆、鉴定和初步的功能研究
 
     论文目录
 
中文摘要第1-10页
英文摘要第10-13页
前言第13-16页
材料和方法第16-43页
 实验材料第16-18页
  一、质粒和载体第16页
  二、菌株第16页
  三、cDNA文库第16页
  四、酶制剂及常用试剂盒第16页
  五、引物第16-17页
  六、放射性同位素第17页
  七、实验用组织第17页
  八、免疫试剂第17页
  九、细胞株及细胞培养用品第17-18页
  十、主要化学试剂及材料第18页
  十一、主要仪器第18页
 实验方法第18-43页
  1.差异显示PCR及PCR产物的克隆第18-21页
   ·差异显示PCR第18页
   ·差异PCR产物末端削平第18-19页
   ·载体pBlueScript-SKⅡ(+)的线性化处理第19页
   ·体外连接反应第19-20页
   ·质粒转化第20页
   ·重组克隆的筛选和鉴定第20页
   ·重组质粒测序模板的提取第20-21页
  2.差异PCR产物(cDNA)测序分析第21页
  3.序列同源性比较第21页
  4.cDNA文库的PCR及杂交筛选第21-23页
   ·点阵cDNA文库的制备和筛选策略第21-22页
   ·PCR筛选点阵cDNA文库第22页
   ·阳性噬菌斑的杂交筛选第22-23页
   ·阳性克隆的纯化第23页
  5.λDR2噬菌体环化为质粒pDR2第23-24页
   ·宿主细菌的制备第23页
   ·环化第23-24页
  6.阳性克隆的鉴定及序列测定第24页
  7.DNA序列和蛋白序列的软件分析第24页
  8.细胞总RNA的提取第24-25页
   ·超速离心的方法提取胎脑组织总RNA第24-25页
     ·主要试剂第24页
     ·具体实验步骤第24-25页
   ·以Trizol试剂提取细胞的总RNA第25页
  9.胎脑组织及成人多组织Northern杂交第25-26页
   ·转膜第25-26页
   ·Northern杂交第26页
     ·成人多组织Northern杂交第26页
     ·胎脑组织总RNA杂交第26页
  10.人的类硫氧化还原蛋白基因(hTRXL)的原核表达与纯化第26-31页
   ·PCR扩增目的片段第26-28页
   ·pET28载体的去磷酸化处理第28页
   ·DNA的酶切、连接、测序第28-29页
   ·重组蛋白的检测及SDS—PAGE电泳第29页
   ·可溶性蛋白的纯化第29-30页
     ·缓冲液第29-30页
     ·树脂的准备第30页
     ·细胞抽提物的制备第30页
     ·柱层析第30页
   ·不可溶蛋白在变性条件下的纯化第30-31页
  11.胰岛素还原实验第31-32页
   ·重组蛋白的脱盐纯化第31页
   ·胰岛素还原实验第31-32页
  12.TRXL在多种淋巴瘤细胞中的表达及它对细胞生长的作用第32页
   ·细胞培养的条件第32页
   ·TRXL在多种淋巴瘤细胞中表达的检测第32页
   ·TRXL对细胞生长的作用第32页
  13.细胞转染第32-34页
   ·真核表达质粒的构建和提取第32页
   ·MCF-7细胞的瞬时转染第32-33页
   ·MCF-7细胞的稳定转染第33页
   ·稳定转染的细胞克隆的细胞凋亡分析第33-34页
     ·细胞凋亡的诱导第33-34页
     ·凋亡细胞的碘化丙啶(PI)排斥分析法第34页
  14.筛选得到的细胞克隆的hTRXL整合和表达分析第34-36页
   ·Southern blot分析外源hTRXL的整合第34-36页
     ·DNA样品的酶解第34页
     ·琼脂糖凝胶电泳第34-35页
     ·Southern印迹第35页
     ·预杂交第35-36页
     ·随机引物法标记DNA探针第36页
     ·杂交第36页
     ·洗膜和放射自显影第36页
   ·稳定整合的细胞克隆中hTRXL表达的Northern检测第36页
  15.多克隆抗体的制备第36-39页
   ·免疫抗原的准备第36页
   ·免疫动物第36-37页
   ·动物放血第37-38页
     ·器械第37页
     ·颈动脉放血第37-38页
   ·酶联免疫吸附实验(ELISA)第38-39页
     ·试剂第38页
     ·实验步骤第38-39页
  16.Western杂交第39-41页
   ·Western-blot杂交用液第39页
   ·细胞总蛋白提取用液第39页
   ·细胞总溶解蛋白提取第39-40页
   ·福林(Folin)-酚法测定蛋白质含量(Lowry法)第40页
   ·Western-Blot蛋白印迹杂交第40-41页
     ·SDS-PAGE电泳以及考马斯亮蓝染色第40页
     ·转膜第40-41页
     ·抗原抗体反应及显色反应第41页
  17.免疫组织化学杂交第41-43页
   ·细胞的处理第41页
   ·杂交用液第41-42页
   ·免疫组化杂交第42-43页
实验结果(一) hTRXL的克隆、鉴定和功能分析第43-72页
 一、mRNA差异显示分析和具有差异表达特征的EST的克隆第43页
 二、人的类硫氧化还原蛋白全长cDNA的筛选第43-45页
  1.EST HFBEST12的分析第43页
  2.人的类硫氧化还原蛋白基因(hTRXL)全长cDNA克隆的筛选第43-45页
 三、人的类硫氧化还原蛋白(hTRXL)全长cDNA的序列测定和分析第45-51页
  1.亚克隆及序列测定第45-46页
  2.序列分析第46-51页
 四、hTRXL的组织表达谱第51-52页
 五、TRXL的原核表达和蛋白纯化第52-59页
  1.pET28b-TRXL的重组质粒的构建第52-54页
  2.TRXL不同区段原核表达克隆的构建第54页
  3.重组质粒在Ecoli中的表达及纯化第54-59页
 六、人的类硫氧化还原蛋白(TRXL)的还原活性检测第59-62页
  1.反应原理第59-60页
  2.重组蛋白的纯化第60页
  3.还原实验第60-62页
 七、hTRXL在多种淋巴瘤细胞中的表达及它对细胞生长的作用第62-64页
  1.hTRXL在多种淋巴瘤细胞中的表达的检测第62-63页
  2.hTRXL对细胞生长的作用第63-64页
 八、pEGFP-TRXL重组质粒真核细胞瞬时表达克隆的构建和真核细胞转染第64-67页
  1.质粒pEGFP-TRXL的构建第64-65页
  2.重组质粒pEGFP-TRXL的真核细胞转染第65-67页
 九.真核表达质粒pCDNA 3.1/Zeo-TRXL稳定表达克隆的筛选第67-72页
  1.pcDNA3.1/Zeo-TRXL重组质粒的构建第67页
  2.稳定表达克隆的筛选和整合克隆的Southern鉴定第67-68页
  3.稳定整合的细胞克隆中hTRXL表达的Northern检测第68-69页
  4.稳定转染的细胞克隆的细胞凋亡分析第69-72页
讨论(一) hTRXL的克隆、鉴定和功能分析第72-78页
 一、类硫氧化还原蛋白(TRXL)与硫氧化还原蛋白(TRX)家族其它成员序列结构上的不同第72-73页
 二、类硫氧化还原蛋白和硫氧化还原蛋白家族的关联和不同第73-74页
 三、与类硫氧化还原蛋白相关的其它蛋白第74-75页
 四、类硫氧化还原蛋白的可能功能推测第75-78页
实验结果(二) 钙周期素结合蛋白基因的克隆和初步功能研究第78-90页
 一、人的钙周期素结合蛋白基因全长cDNA克隆的筛选第78-81页
  1.全长cDNA克隆的获得第78-80页
  2.cDNA编码序列的特征分析第80-81页
 二、人的钙周期素结合蛋白基因(CacyBP)的原核表达和蛋白纯化第81-85页
  1.pET28c-CacyBP的重组质粒的构建第81-83页
  2.pET28c-CacyBP重组质粒在Ecoli中的表达及纯化第83-85页
 三、CacyBP的Northern Blot分析第85页
 四、基因组DNA的Southern杂交第85-86页
 五、人的钙周期素结合蛋白的Western Blot杂交结果第86-87页
 六、BT325细胞的免疫组织化学杂交结果第87-90页
讨论(二) 钙周期素结合蛋白基因的克隆和初步功能研究第90-93页
小结第93-95页
参考文献第95-100页
论文综述第100-108页
附录Ⅰ、英、汉名词对照第108-109页
附录Ⅱ、对本文所克隆基因命名的说明第109-110页
致谢第110页

 
 
论文编号BS835233,这篇论文共110
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