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骨髓间充质干细胞输注对再生障碍性贫血模型小鼠骨髓造血功能的影响其它医学
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【动物中医学毕业论文】【摘要】 本 研究 探讨人源骨髓间充质干细胞（MSC）输注对免疫介导性再生障碍性贫血模型小鼠骨髓造血功能及生存率的 影响 .采用雌性BALB/c小鼠30只，参照姚军等 方法 建立免疫介导性再生障碍性贫血模型，实验分模型组、MSC组及照射组。MSC组于制模后3天从小鼠尾静脉1次性输注人骨髓MSC 1×106，观察各组小鼠外周血象变化、第28天存活率、骨髓有核细胞数量、造血集落生成和骨髓病 理学 特征。结果显示：于制模后第7天，模型组外周血WBC 显著低于MSC组和照射组，分别为（0.65±0.05）×109/L，（2.45±0.71）×109/L，（2.30±0.33）×109/L；第10天3组均表现为全血细胞减少，第14天模型组血象指标仍持续降低，而MSC组及照射组血象指标开始回升，至28天3组小鼠存活率分别为18.2%、80%和100%，MSC组小鼠存活率显著高于模型组（p<0.01）。MSC组小鼠单侧股骨有核细胞数量、造血祖细胞集落生成数量均显著高于模型组，而与照射组结果一致。结论：MSC输注可减轻再生障碍性贫血模型小鼠骨髓造血衰竭程度，提高存活率。
【关键词】 再生障碍性贫血
Effect of Bone Marrow Mesenchymal Stem Cell Infusion on Hemato poiesis in Mice with Aplastic Anemia
Abstract To explore the effects of infusion with human mesenchymal stem cells from bone marrow on bone marrow hematopoietic function and survival in mice with aplastic anemia (AA), immunomediated aplastic anemia mice model was established according to Yao′s method. Thirty BALB/c female mice were divided into AA model group, MSC group and radiation group. In MSC group, 1×106 MSC was infused by intravenous injection at 3 days after establishment of model. The changes of blood count， the number of nuclear cells in a single thighbone, colonyforming units(CFU), pathological features of bone marrow and survival rate of mice were observed in all groups. The results showed that the number of white blood cells in peripheral blood of AA model group at day 7 after establishment of model was （0.65±0.05）×109/L , which was significantly lower than those in MSC group and radiation alone group, respectively. Pancytopenia was found in all three groups at day 10. At day 14 the pancytopenia was continued in AA model group while it was less severe in MSC and radiation groups. In MSC group the number of nucleated cells in single thigh bone and pathological slice as well as CFUGM were significantly higher than those in AA model group, respectively. The survival rate of mice in MSC group was 80.0% which was higher than that of group in AA model (18.2%, p<0.01).There were no significant differences between MSC group and radiation alone group in bone marrow hematopoiesis and survival rate. It is concluded that MSC infusion reduces the degree of bone marrow failure and improve survival of immunomediated AA mice model.
Key words aplastic anemia； animal model； mesenchymal stem cell； hematopoiesis
骨髓间充质干细胞（mesenchymal stem cells, MSC）除具有促进造血干细胞移植后造血重建外，还具有免疫调节作用，防治移植物抗宿主病［1，2］。获得性再生障碍性贫血主要是T淋巴细胞介导的骨髓造血功能衰竭［3，4］，且再生障碍性贫血患儿骨髓MSC体外增殖能力较正常对照儿童明显减弱［5］。本研究探讨人源骨髓MSC 对免疫介导性再生障碍性贫血小鼠骨髓造血功能及生存率的影响，再生障碍性贫血模型的建立
清洁级雌性BALB/c小鼠（H2d、Mlsb），8-10周龄，16-18 g，作为受者。清洁级DBA/2小鼠（H2d、Mlsa），6-10周龄，为淋巴细胞供者。两者均由中山大学动物实验中心提供。参照 文献 ［6］建立免疫介导性再生障碍性贫血模型。取DBA/2小鼠颈椎脱臼处死，常规消毒，无菌取出胸腺及颈部、颌下、腋窝、腹股沟、肠系膜等处淋巴结，分别获胸腺、淋巴结细胞悬液,细胞浓度为5×106/ml，按胸腺细胞与淋巴结细胞以1∶2比例混合，即胸腺淋巴结细胞悬液。台盼蓝鉴定细胞活性，活性细胞>95%。雌性BALB/c小鼠经5 Gy 60Co γ射线全身照射（剂量率125.35 cGy/min），照射后20小时内由尾静脉注入DBA/2小鼠胸腺淋巴结细胞1×106/只。小鼠照射后立即移入中山大学动物实验中心SPF级无菌层流室内，饮用加有庆大霉素（40万U/L）和二性霉素B（50 mg/L）高压灭菌水，每日观察并记录小鼠体重、活动力、外表、饮食、大便、死亡情况，制模后28天实验终止。
MSC分离、扩增及输注
取正常儿童骨髓2 ml，按本室已建立的方法［7］进行MSC分离、扩增，传代至4-5代时收获细胞，于制模后第3天（照射后72小时）经小鼠尾静脉注射人源MSC 1×106。
实验分组
雌性BALB/c小鼠30只，分为3组：①再生障碍性贫血模型组：11只，照射+胸腺淋巴结细胞输注；②MSC组：10只，照射+胸腺淋巴结细胞输注+MSC输注；③单纯照射组： 9只，仅照射。
观察指标
生存率及生存曲线。 比较各组小鼠生存情况。
外周血象检测 于制模后第7、10、14、21天分别断尾，微量吸管采集肝素抗凝血20 μl，细胞计数仪检测白细胞（WBC）、血红蛋白（Hb）、血小板（Plt）水平。
单侧股骨有核细胞数测定及骨髓造血祖细胞集落培养 于制模后28天或濒死时颈椎脱臼处死实验小鼠，在无菌条件下取出右侧股骨，用不含血清IMDM培养液冲洗细胞，离心，弃上清，加1 ml IMDM混匀，计单测股骨有核细胞数量。取2×104 细胞接种于1 ml甲基纤维素半固体培养基MethocultTM GFM3434（美国Stem Cell公司产品）中进行造血祖细胞集落培养，于第7天在倒置显微镜下计数粒巨噬细胞集落（CFUGM）。
组织学检查 于制模后28天或濒死时颈椎脱臼处死实验小鼠，取小鼠肝、脾及左侧股骨，富尔马林固定，石蜡包埋切片，HE染色,显微镜下观察组织学变化。
统计学处理
用SPSS 11.5 软件处理资料，多组均数的比较采用OnewayANOVA, 绘制KaplanMeier生成函数曲线并对其进行Log Rank检验。
结 果
MSC对再生障碍性贫血小鼠存活率的 影响
照射组于照射后2-3天、2周体重轻微下降，3周左右恢复正常，至28天时均存活。模型组于制模后3-7天体重明显下降，第9天略有回升，12天再次明显下降，苍白、活动明显减少，弓背，松毛，9只于12-19天死亡，解剖发现各脏器苍白，胸腺、脾脏、淋巴结萎缩，部分小鼠小肠有出血点，另2只于3周后体重回升，活动渐增多，毛光滑，模型组小鼠28天存活率为18.2%。MSC组体重变化与照射组相似，2只于16天死亡，其28天存活率为80%。各组KaplanMeier生存函数曲线如图1所示，MSC组与模型组生存曲线比较差别具有极显著意义（Log Rank统计量=7.33，p=0.0068）。
MSC对外周血象的影响
结果见附表。如表所示，模型组小鼠于制模后7天WBC明显下降，与MSC组及照射组比较差异均具有显著意义（p<0.01）；10天时3组血象指标均显著降低；14天时模型组外周血象仍明显降低，而MSC组和照射组开始回升，至21天血象基本恢复正常。9只再生障碍性贫血模型鼠于3周内死亡，2只生存至21天时血象亦逐渐回升。
MSC对骨髓造血的影响
再生障碍性贫血模型小鼠濒死前单测骨髓有核细胞数为0.03×107，存活至28天的2只小鼠骨髓有核细胞数均为0.3×107，造血集落培养在实验中均无集落形成；制模后28天 MSC组骨髓有核细胞数平均为1.3 ×107，显著高于模型组（p<0.01），集落培养可见30-50个CFUGM生长。照射组与MSC组结果一致。骨髓病理切片如图2所示，模型组骨髓有核细胞增生明显减低，有核细胞数明显减少，由大量脂肪细胞填充骨髓腔，而MSC和照射组骨髓增生活跃，脂肪细胞较少，以MSC组更为显著。
讨 论
再生障碍性贫血模型小鼠经亚致死量射线照射后，造血干细胞和骨髓微环境均受到严重损伤，当输入次要组织相容性抗原不合的小鼠胸腺淋巴结细胞后，可进一步诱导免疫性骨髓造血功能损伤。再生障碍性贫血小鼠的病理改变与人类再生障碍性贫血相似，是 目前 筛选 治疗 药物较理想的再生障碍性贫血模型［6］。姚军等采用的照射剂量是6 Gy，再生障碍性贫血发生率为96.2%，死亡时间集中在制模后8-14天。我们在预实验中采用6 Gy照射剂量，4只照射小鼠于照射后2周左右均死亡，6只模型小鼠于制模后7-8天全部死亡，照射剂量偏大。本 研究 将照射剂量调整为5 Gy，照射组小鼠均出现一过性全血细胞减少，3周左右血象基本恢复正常，而模型组小鼠于制模后1周出现血象下降，81.8%于3周内因造血功能衰竭死亡，病理检查符合再生障碍性贫血表现。
MSC具有高增殖和多向分化潜能，易于采集、分离纯化和体外扩增，不表达或仅表达可忽略水平的MHCⅡ及T细胞共刺激分子B71、B72、CD40、CD40L，免疫原性弱［7］，在细胞治疗、基因治疗中具有广泛的 应用 前景。近年来证实，MSC除具有促进体内造血重建外，还具有抑制同种异基因免疫反应、降低移植物抗宿主病的作用［1,2］。本研究结果显示，于制模后3天静脉输注MSC可减慢再生障碍性贫血模型小鼠白细胞下降速度，促进骨髓造血恢复，明显降低死亡率。骨髓病理切片结果进一步证实，MSC静脉输注对再生障碍性贫血小鼠骨髓造血恢复具有积极作用。MSC促进再生障碍性贫血小鼠骨髓造血恢复的机制尚不清楚，可能与下列因素有关：①免疫负调节作用：体外实验证实，MSC具有抑制异基因淋巴细胞增殖作用，且有剂量依赖性，但其作用机制尚不十分清楚。陆晓茜等［2］认为，MSC可能是通过细胞间相互作用及诱导T淋巴细胞亚群由Th1、Tc1向Th2、Tc2极化有关；宁红梅等［8］体外实验研究提示，MSC的免疫负调节作用可能与诱导CD4+CD25+免疫调节性T细胞增高有关。本研究于制模后3天输入一定剂量的MSC，在一定程度上可以抑制胸腺淋巴结细胞介导的针对造血系统的免疫反应，从而减轻免疫介导性骨髓损伤。MSC组小鼠外周血象和骨髓病理改变与单照射组小鼠结果基本一致，这些高度提示MSC主要是通过免疫负调节作用抑制再生障碍性贫血小鼠体内免疫反应，从而改善再生障碍性贫血小鼠预后。②修复造血微环境，促进骨髓造血：射线照射可严重损伤骨髓造血细胞和造血微环境，MSC有向损伤组织处及炎症反应部位迁移的特性，给再生障碍性贫血小鼠静脉输注MSC可使MSC主要归巢至骨髓，并通过细胞间直接接触或通过分泌转化生长因子β1、造血生长因子等间接方式发挥造血支持、组织修复和局部免疫调节作用。
绝大多数儿童再生障碍性贫血是T淋巴细胞介导的免疫性骨髓损伤，免疫抑制治疗有效率达79%［9］，但其中部分患儿血象恢复不完全或复发，且仍有少部分患儿对免疫抑制治疗无效。除同胞HLA全相合骨髓移植外，目前对免疫抑制治疗无效或复发的患儿尚缺乏有效治疗 方法 ，临床上亟待探索新的治疗手段。MSC因具有免疫负调节及支持造血双重作用，且具有可移植性，在再生障碍性贫血细胞治疗中可能发挥重要作用。
【 参考 文献 】
1Novelli E, Buyaner D, Chopra R, et al. Human mesenchymal stem cells can enhance human CD34+ cells repopulation of NOD/SCID mice. Blood,1998; 92:116a
2陆晓茜，刘霆，孟文彤等.人骨髓间充质干细胞对淋巴细胞的免疫调节作用. 中国 实验血液学杂志，2005;13：651-655
3黄永兰，黄绍良，包蓉等. 再生障碍性贫血儿童TCR Vβ 亚家族T细胞克隆性增殖及其与HLADRB1*15的关系. 中山大学学报·医学 科学 版， 2006; 27：161-168，172
4黄永兰，黄绍良，魏菁等. 再生障碍性贫血患儿骨髓造血干/祖细胞缺陷与细胞免疫功能异常的关系. 中华血液学杂志，2006;27：129-131
5陈静，王茜，施英唐等. 再生障碍性贫血患儿骨髓间充质干细胞的生物学特点. 中国实验血液学杂志，2005；13：832-838
6姚军，李树浓.淋巴细胞与再生障碍性贫血关系的实验研究.中华血液学杂志，1991;12：229-231
7周敦华，黄绍良，吴燕峰等.人间充质干细胞体外扩增及生物学特性的研究.中华儿科杂志，2003;41：607-610
8宁红梅，金建刚，扈江伟等. 人骨髓间充质干细胞体外对异基因T淋巴细胞表型的影响. 中国实验血液学杂志，2005;3：43-49
9Fang JP, Xu HG, Huang SL, et al. Immunosuppressive treatment of aplastic anemia in chinese children with antithymocyte globulin and cyclosporine. Pediatri Hematol Oncol, 2006; 23:45-50
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