摘要 | 第4-5页 |
Abstract | 第5-6页 |
英文缩略表 | 第7-11页 |
1. 引言 | 第11-21页 |
1.1 过氧化氢酶 | 第11-15页 |
1.1.1 过氧化氢酶的研究进展 | 第11-13页 |
1.1.2 过氧化氢酶的结构 | 第13-14页 |
1.1.3 过氧化氢酶的商业化生产 | 第14页 |
1.1.4 过氧化氢酶在食品行业的应用 | 第14-15页 |
1.2 斯氏假单胞菌 | 第15-17页 |
1.2.1 斯氏假单胞菌的发现 | 第15页 |
1.2.2 斯氏假单胞菌的研究现状 | 第15-17页 |
1.3 改善酶学性质的策略 | 第17-19页 |
1.3.1 定向进化 | 第17-18页 |
1.3.2 半理性设计 | 第18页 |
1.3.3 理性设计 | 第18-19页 |
1.4 本研究的目的和意义 | 第19-21页 |
2. 高过氧化氢酶活性菌株的筛选 | 第21-28页 |
2.1 实验材料 | 第21-22页 |
2.1.1 实验菌株 | 第21页 |
2.1.2 实验主要仪器 | 第21页 |
2.1.3 酶与引物 | 第21-22页 |
2.1.4 培养基及实验相关溶液 | 第22页 |
2.2 试验方法 | 第22-24页 |
2.2.1 细菌分离及过氧化氢酶活性初筛 | 第22-23页 |
2.2.2 菌株过氧化氢酶活性检测 | 第23页 |
2.2.3 过氧化氢酶活力测定方法 | 第23页 |
2.2.4 高过氧化氢酶活性菌株的鉴定 | 第23-24页 |
2.3 试验结果 | 第24-27页 |
2.3.1 平板检测结果 | 第24页 |
2.3.2 高酶活菌株的筛选结果 | 第24-25页 |
2.3.3 菌株鉴定 | 第25-27页 |
2.4 讨论 | 第27页 |
2.5 本章小结 | 第27-28页 |
3. 过氧化氢酶基因的克隆及其性质分析 | 第28-53页 |
3.1 实验材料 | 第28-32页 |
3.1.1 菌株与质粒 | 第28页 |
3.1.2 实验主要仪器 | 第28页 |
3.1.3 酶、引物及主要试剂 | 第28-29页 |
3.1.4 培养基及实验相关溶液 | 第29-32页 |
3.2 试验方法 | 第32-40页 |
3.2.1 序列分析软件 | 第32页 |
3.2.2 基因组的提取 | 第32-33页 |
3.2.3 目的基因的获取 | 第33-34页 |
3.2.4 pET30a(+)质粒提取 | 第34-35页 |
3.2.5 目的基因的酶切和回收 | 第35-36页 |
3.2.6 载体的酶切和回收 | 第36页 |
3.2.7 目的基因和载体的连接 | 第36页 |
3.2.8 大肠杆菌TOP10感受态细胞的转化 | 第36-37页 |
3.2.9 阳性克隆鉴定及测序 | 第37页 |
3.2.10 大肠杆菌BL21感受态细胞的转化 | 第37-38页 |
3.2.11 阳性克隆的鉴定 | 第38页 |
3.2.12 过氧化氢酶在大肠杆菌中的表达 | 第38页 |
3.2.13 过氧化氢酶菌体的破碎 | 第38页 |
3.2.14 表达产物所在位置的检测 | 第38-39页 |
3.2.15 过氧化氢酶的纯化 | 第39页 |
3.2.16 过氧化氢酶最适温度及温度稳定性的测定 | 第39-40页 |
3.2.17 过氧化氢酶最适pH和pH稳定性的测定 | 第40页 |
3.2.18 不同金属离子对过氧化氢酶的影响 | 第40页 |
3.2.19 过氧化氢酶催化动力学参数的测定 | 第40页 |
3.3 结果和分析 | 第40-49页 |
3.3.1 过氧化氢酶KatE蛋白质的理化性质预测 | 第40-41页 |
3.3.2 过氧化氢酶KatE蛋白质的二级结构预测 | 第41-42页 |
3.3.3 目的基因katE的获取 | 第42-43页 |
3.3.4 表达载体pET30a-katE的构建 | 第43-44页 |
3.3.5 重组过氧化氢酶KatE的诱导表达 | 第44-45页 |
3.3.6 重组过氧化氢酶KatE的纯化 | 第45-46页 |
3.3.7 过氧化氢酶KatE的最适温度及温度稳定性 | 第46页 |
3.3.8 过氧化氢酶KatE的最适pH及pH稳定性 | 第46-47页 |
3.3.9 不同金属离子对过氧化氢酶KatE的影响 | 第47页 |
3.3.10 过氧化氢酶KatE的催化动力学参数的测定 | 第47-48页 |
3.3.11 过氧化氢酶KatE蛋白质序列比对 | 第48-49页 |
3.4 讨论 | 第49-52页 |
3.5 本章小结 | 第52-53页 |
4. 正交实验设计多点突变提高过氧化氢酶稳定性 | 第53-65页 |
4.1 实验材料 | 第53-55页 |
4.1.1 菌株与质粒 | 第53页 |
4.1.2 试验主要仪器 | 第53页 |
4.1.3 酶、引物及主要试剂 | 第53-55页 |
4.1.4 培养基及试验相关溶液 | 第55页 |
4.2 试验方法 | 第55-59页 |
4.2.1 多点突变体的设计方法 | 第55-56页 |
4.2.2 最优多点突变体的设计方法 | 第56页 |
4.2.3 pET30a-katE的质粒提取 | 第56页 |
4.2.4 pET30a-katE的突变设计 | 第56-58页 |
4.2.5 过氧化氢酶突变体在大肠杆菌TOP 10菌株中的转化和阳性鉴定 | 第58页 |
4.2.6 过氧化氢酶突变体在大肠杆菌中感受态BL21的转化 | 第58页 |
4.2.7 过氧化氢酶突变体在大肠杆菌中的表达 | 第58页 |
4.2.8 过氧化氢酶突变体的纯化 | 第58页 |
4.2.9 野生型及突变体酶活力的测定 | 第58页 |
4.2.10 野生型及突变体热稳定性的测定 | 第58页 |
4.2.11 野生型及突变体DSC的检测 | 第58-59页 |
4.3 结果与分析 | 第59-63页 |
4.3.1 多点突变体过氧化氢酶M1~M11的纯化结果 | 第59页 |
4.3.2 野生型和多点突变体M1~M11的酶活测定 | 第59-60页 |
4.3.3 野生型及多点突变体M1~M11的热稳定性测定 | 第60页 |
4.3.4 正交分析 | 第60-61页 |
4.3.5 最优突变体过氧化氢酶的纯化 | 第61-62页 |
4.3.6 野生型及最优突变体酶活力的测定 | 第62页 |
4.3.7 野生型及最优突变体热稳定性的测定 | 第62-63页 |
4.4 讨论 | 第63-64页 |
4.5 本章小结 | 第64-65页 |
5. 全文总结与展望 | 第65-66页 |
5.1 全文总结 | 第65页 |
5.2 展望 | 第65-66页 |
参考文献 | 第66-75页 |
作者简历 | 第75-76页 |
致谢 | 第76页 |