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阴道毛滴虫衰老生物学标志分子β_半乳糖苷酶基因克隆和蛋白表达
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【专科药学毕业论文】【摘要】 目的:克隆并分析阴道毛滴虫(Trichomonas vaginalis, Tv)衰老生物学标志分子β_半乳糖苷酶(β_gal)同源基因，表达β_GAL重组蛋白。方法:从Tv cDNA表达文库中分离获得Tv β_gal同源基因的cDNA克隆，测序和序列分析。将cDNA部分片段亚克隆到原核表达载体(pQE_80L)，转化宿主菌E.coli SG13009，异丙基_β_D_硫代半乳糖苷诱导表达，聚丙烯酰胺凝胶电泳分析鉴定。结果:在Tv cDNA文库中获得1株2445bp的cDNA克隆。序列分析表明，该序列开放读码框有2415bp，推测肽链具有804个氨基酸,等电点为54；该肽链与多种来源的β_GAL同源蛋白均具有较高同源性。用PCR扩增了该cDNA序列中的2277bp片段，构建了pQE_80L/Tv β_gal,所表达重组蛋白产物的相对分子质量为82ku。结论:推测该克隆是Tv β_gal的同源基因，Tv β_gal基因可以在E.coli中得到表达，为进一步研究其细胞内定位和蛋白功能奠定了基础。
【关键词】 阴道毛滴虫 β_半乳糖苷酶 cDNA克隆
2Heyuan Entry_Exit Inspection and Quarantine Bureau, Heyuan 517000, China)［Abstract］Objective：To clone and analyze Trichomonas vaginalis(Tv)β_galactosidase(Tv_β_gal)homology gene , and to express the recombinant protein. Methods：One cDNA clone, with high homology of β_gal, was isolated from Tv cDNA library. The cDNA was sequenced and analyzed. Then a fragment of the cDNA was cloned to the expression vector pQE_80L. E.coli SG13009 cell was transformed by the recombinant plasmid. The expression of protein was induced by isopropyithio_β_D_galactoside. Sodium dodecyl sulfate_polya_crylamide gel electrophoresis analysis was performed to detect the recombinant protein. Results：One cDNA clone with a length of 2 445 bp was isolated. The cDNA clone had an open reading frame with 2 415 bp. The deduced amino acid sequence contains 804 residues and its isoelectric point is 54. The cDNA clone was high homology to the β_gal homologus of different species. A 2 277 bp fragment of the cDNA was amplified by PCR and therecombinant expression plasmid(pQE_80L/Tv β_gal)was constructed. The fusion protein of Tv β_GAL(about 82 ku)was expressed. Conclusion：The cDNA clone isolated belongs to β_gal homolog. Tv β_gal is expressed well in E.coli, which will be helpful for the further study on the location and function of Tv β_gal in Tv.
［Key Words］Trichomonas vaginalis; β_galactosidase; cDNA clone
β_半乳糖苷酶(β_GAL)，广泛存在于各种动物、植物及微生物中。早期只是利用该酶水解乳糖的性质来降低牛乳中的乳糖含量,改善人类对牛乳乳糖的不耐受反应。随着生物技术的发展，对编码该酶的基因结构有了深入地了解，使得该酶不仅在食品工业中的用途越来越广，而且在生物技术领域(基因工程、酶工程、蛋白工程方面)都发挥着重要作用，并广泛用于化学、医药等领域。近年来，发现了一种在衰老细胞中表达的β_GAL，而休眠和终末分化的细胞及永生化细胞缺乏或不表达。大多数细胞表达溶酶体β_GAL，在pH=4时具有活性［1］，而衰老细胞中表达的β_GAL在pH=6时活性最高，所以该酶可以作为体内鉴别衰老细胞的生物学标志而被广泛应用［2］。本研究以单细胞真核原生生物阴道毛滴虫(Trichomonas vaginalis， Tv)为模式生物，拟观察β_GAL的表达水平是否也能反映单细胞原生生物的衰老变化。初步报道Tv β_gal基因的克隆、序列分析和重组蛋白的表达及鉴定。
1材料与方法
11细胞株及其培养Tv LX006细胞株(本实验室保存)取自汕头大学医学院第一附属医院患者。细胞株于改良的TYM(tryptone/yeast extract/maltose)［3］培养基中(去除其中的麦芽糖成分，增加体积分数10%的小牛血清和质量分数1%的葡萄糖)37℃恒温传代培养至对数生长晚期［约48h，细胞数(4～8)×106个/mL］离心收集细胞(2500r/min，10min);用磷酸盐缓冲液(01mol/L，pH 72)洗涤2遍后，提取总RNA和基因组DNA。
12 Tv β_gal cDNA克隆我室已构建Tv的cDNA文库［4］，在分离cDNA克隆和测序的过程中，获得1个与β_gal及其同源基因有较高同源性的cDNA克隆，命名为Tv β_gal(GenBank accession number:EF107527)。
13Tv β_gal基因组DNA及cDNA克隆及鉴定以标准方法［5］提取Tv细胞基因组DNA，根据Tv β_gal cDNA序列，利用DNAman软件设计PCR引物(上游:5′_ATCTGGGTATTAAACAATGC_3′，下游:5′_TTATTTTGATGTCATTGTAA_3′)。分别以基因组DNA和cDNA为模板,用PTC_150 PCR仪(MJ研究公司，美国)进行PCR扩增(Clontech PCR试剂盒，美国)。扩增反应条件：94℃预变性3min，94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸3min，30个循环；72℃延伸10min。PCR产物直接亚克隆入质粒(pGEM_T easy,普洛麦格公司，美国)，构建pGEM_T/Tv β_gal重组质粒，并转化宿主菌大肠矣希菌(E.coli)JM109，挑取阳性克隆并提取质粒由上海基康生物技术有限公司进行测序鉴定。用相似序列比对工具对基因组DNA和cDNA序列进行比对。
14 Tv β_GAL序列分析使用在线分析软件Blastp在GenBank数据库中查找同源序列［6］。在推导的氨基酸序列中查找并标示β_GAL家族蛋白酶活性必须的氨基酸残基(Glu_420, Glu_485, Gly_734)。
15进化树分析在GenBank中查找各种不同生物的β_GAL及其同源蛋白的氨基酸序列，应用ClastW182(使用默认参数)进行序列比对。用MEGA3软件进行进化树分析［7］。
16 Tv β_GAL重组蛋白的表达
161目的片段准备根据Tv β_gal基因开放读码框设计合成引物,扩增开放读码框架内2277bp片段。 引物序列为上游: 5′_ATGGATCCGCAGCATTC_AGTAGATCATCAGAT_3′， 下游: 5′GGCTGCAGAGTC_CCTTAGCAGAAGCCTC_3′。在上、下游引物5′端分别加入EcoRV和PstI的酶切位点(下划线部分)。以cDNA克隆为模板进行PCR扩增。扩增反应条件同前。质量分数1%的琼脂糖凝胶电泳分离后，用凝胶回收试剂盒(快而精有限公司，德国)回收纯化目的片段，与pGEM_T easy连接，转化感受态E.coli JM109，挑取阳性克隆并提取质粒进行酶切鉴定后测序。
162 pQE_80L/Tv β_gal重组质粒的构建取上述重组载体及pQE_80L(快而精有限公司，德国)分别用EcoRV、PstI(纽英伦生物技术有限公司，美国)进行双酶切，凝胶纯化目的蛋白及载体片段。将pQE_80L与Tv β_gal酶切片段在T4连接酶(纽英伦生物技术有限公司，美国)的作用下16℃连接15h，转化E.coli SG13009(快而精有限公司,德国)，挑取克隆，提取质粒进行酶切鉴定后测序。
163重组蛋白诱导表达异丙基_β_D_硫代半乳糖苷(IPTG)诱导阳性克隆SG13009 5h，收集诱导前、诱导培养5h以及未诱导同步培养5h各时间段1mL细胞的沉淀。每1份沉淀重悬于100μL 1×十二烷基硫酸钠凝胶加样缓冲液中，100℃加热3min，各取15μL，用质量分数12%的聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定。
2结果
21Tv β_gal cDNA及基因组DNA序列分析从Tv的cDNA文库中分离得到的Tv β_gal cDNA克隆包括翻译起始密码子和终止密码子在内共有2445bp，其中开放读码框架长度为2415bp，推导编码804个氨基酸残基的多肽，分子质量90847u,推算其等电点为54(图1)。根据Tv β_gal cDNA序列设计PCR引物，再以Tv基因组DNA为模板进行扩增，扩增产物与预期分子质量大小一致(图2)，包括起始子和终止子，序列对比其与Tv β_gal cDNA对应序列完全一致,说明Tv β_gal基因组DNA不含内含子。
22 序列同源性分析从原核生物细菌到高等哺乳动物人类同源蛋白质的氨基酸序列保守结构域分析提示，β_GAL与细菌同源蛋白均具有较高的同源性。其中与多型拟杆菌的β_GAL同源性最高，在793个氨基酸的保守序列区，一致性和相似性达58%和74%,其次是黄杆菌属，在786个氨基酸中一致性和相似性分别为50%和66%。与热纤梭菌在730个氨基酸中一致性和相似性分别为40%和56%。与野油菜黄单包菌在812个氨基酸中一致性和相似性分别为37%和52%。
23v β_GAL保守结构域分析由Tv β_gal cDNA所推导出氨基酸序列，与细菌到人类不同生物的β_GAL比对，与E.coli、多型拟杆菌、黄杆菌属、热纤梭菌等进行结构比较分析结果显示，其氨基酸序列具有β_GAL活性必须的氨基酸残基(Glu_420, Glu_485, Gly_734)(图3)。
24 Tv β_GAL及其同源蛋白的生物进化分析Tv β_GAL与各种不同生物的β_GAL同源蛋白质进化树分析结果显示，Tv β_GAL接近构巢曲霉菌和E.coli的蛋白(图4)。
25Tv β_gal cDNA片段与pQE_80L重组质粒及融合蛋白的表达与鉴定将Tv β_gal cDNA片段克隆至pQE_80L，转化宿主菌E.coli SG13009，提取质粒酶切，得到与目的片段大小一致的条带(图5)。用IPTG诱导其表达。聚丙酰胺烯凝胶电泳显示，表达产物的分子质量约为82ku,与预期一致(图6)。经DNA测序证明重组表达质粒读码框正确，插入cDNA序列无误。
3讨论
β_GAL属于水解酶类，能专一催化乳糖,水解β_半乳糖苷键。该酶能将乳糖水解为半乳糖与葡萄糖，也具有半乳糖苷的转移作用。由LacZ基因编码的E.coli β_GAL由1023个氨基酸残基组成。此酶的催化机制类似于溶菌酶，为酸碱协同催化。该酶的定位突变研究结果表明，酶分子中的Tyr_503残基起酸碱调节作用［8］，而Glu_461残基可能具有稳定半乳糖中间酰化物的功能，它同底物结合有关，以半乳糖酰阳离子的形式，或形成共价中间物，或二者兼而有之［9］，可同底物形成络合物。Glu_537残基是β_GAL的必需基团之一，在催化过程中提供1个游离羧基，起协同催化作用，可协同对底物的络合。β_gal基因由于来源丰富，产物易于检测等优点被广泛应用于基因研究的各个领域。β_GAL可催化乳糖分解为一分子的葡萄糖和一分子的半乳糖，还可催化5_溴_4_氯_3_吲哚_β_D_半乳糖苷(X_gal)水解，产物呈蓝色，便于检测和观察，基于此特点，LacZ基因常作为载体基因被广泛应用于基因学研究当中。在构建表达载体时，将β_gal基因置于启动子的下游，通过检测蓝色斑的形成来筛选构建成功的表达载体。利用该酶的活性检测，β_gal基因可作为报告基因应用于基因治疗和转基因的研究中，通过检测表达的β_GAL来对转染率进行研究和转染条件的优化。此外，在研究启动子的效能、启动子不同位点突变对表达效能的影响［10～12］以及表达系统中增强序列、调控序列［13～15］研究等方面，也常把β_gal基因作为报告基因。在蛋白质工程方面，常把外源蛋白基因重组于GAL融合蛋白表达载体中，可通过IPTG诱导融合蛋白的表达，也可通过检测GAL的活性来对产物定量，该产物中的GAL不会影响外源蛋白的活性［16］。在生物医药应用方面，β_GAL做为一种酶类药物适用于各种消化不良；该酶在戊二醛作用下与抗体标记还可应用于酶联免疫(ELISA)检测程序［17］。Dimiri等［2］发现体外培养的人二倍体成纤维细胞在pH=6时，其β_GAL染色的阳性率随代龄增加而增加，他们把这种中性β_GAL定义为衰老生物学标志分子β_GAL。血清饥饿引发的生长抑制并不能提高β_GAL的活性，Werner综合征患者皮肤成纤维细胞体外培养时增殖能力的丧失快于正常人，同时β_GAL阳性细胞的积累也加快。永生化细胞检测不到β_GAL的活性，转基因技术诱导永生化细胞衰老的同时，也诱导β_GAL的活性。而且，老年个体皮肤组织切片β_GAL染色的阳性率高于年轻个体。基于以上观察，Dimiri提出这种中性β_GAL是一种很好的可用于体内外衰老研究的生物学标志。β_GAL的检测大多采用组织化学染色方法，简单易行，是目前应用较为广泛的衰老生物学标志。为了研究Tv β_gal在Tv细胞衰老状态的表达水平，我们克隆了Tv β_gal基因，应用生物软件进行了多项序列分析和预测。Tv β_gal基因的cDNA克隆序列包括开放读码框2415bp，编码804个氨基酸的多肽链，翻译起始密码子前17个碱基处具有核糖体结合位点识别序列AAGGA A。序列分析表明，Tv β_GAL与多种来源的β_GAL都有很高的同源性，且具有β_GAL活性必需的4个保守氨基酸。推测Tv β_GAL可能分布于细胞壁或细胞外。这些资料提示，Tv β_GAL可能是β_GAL的同源蛋白。下一步作者将对Tv β_GAL细胞内定位及其与寿命和衰老的相关性进行深入研究。
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