| 摘要 | 第6-8页 |
| Abstract | 第8-9页 |
| 1 引言 | 第10-18页 |
| 1.1 纤维素酶 | 第10-11页 |
| 1.2 产纤维素酶的微生物 | 第11-13页 |
| 1.2.1 产纤维素酶的细菌 | 第11-12页 |
| 1.2.2 产纤维素酶的真菌 | 第12-13页 |
| 1.3 纤维素酶蛋白质工程改造的研究进展 | 第13-16页 |
| 1.3.1 纤维素酶的理性设计 | 第13-15页 |
| 1.3.2 纤维素酶的定向进化 | 第15-16页 |
| 1.4 展望 | 第16-17页 |
| 1.5 研究意义与内容 | 第17-18页 |
| 2 材料与方法 | 第18-26页 |
| 2.1 供试菌株与质粒 | 第18页 |
| 2.2 实验试剂 | 第18页 |
| 2.3 实验方法 | 第18-26页 |
| 2.3.1 内切葡聚糖酶Ⅰ酶活力的测定 | 第18-19页 |
| 2.3.2 热激法转化外源DNA片段至E.coli Top 10细胞 | 第19-20页 |
| 2.3.3 电穿孔法转化外源DNA片段至E.coli Top10细胞 | 第20页 |
| 2.3.4 长枝木霉总RNA的提取 | 第20页 |
| 2.3.5 长枝木霉内切葡聚糖酶Ⅰ CDS片段的克隆 | 第20-21页 |
| 2.3.6 内切葡聚糖酶Ⅰ CDS片段的TA克隆 | 第21页 |
| 2.3.7 信息学分析 | 第21页 |
| 2.3.8 内切葡聚糖酶Ⅰ的随机突变 | 第21-22页 |
| 2.3.9 内切葡聚糖酶Ⅰ的DNA改组 | 第22-23页 |
| 2.3.10 内切葡聚糖酶Ⅰ表达载体的构建 | 第23页 |
| 2.3.11 电穿孔法转化外源DNA至毕赤氏酵母细胞及阳性克隆的筛选 | 第23-24页 |
| 2.3.12 重组内切葡聚糖酶Ⅰ的诱导表达 | 第24页 |
| 2.3.13 重组内切葡聚糖酶Ⅰ诱导表达的SDS-PAGE分析 | 第24页 |
| 2.3.14 诱导时间对重组内切葡聚糖酶Ⅰ分泌的影响 | 第24页 |
| 2.3.15 甲醇浓度对重组内切葡聚糖酶Ⅰ分泌的影响 | 第24-25页 |
| 2.3.16 重组内切葡聚糖酶Ⅰ最适作用温度的测定 | 第25页 |
| 2.3.17 重组内切葡聚糖酶Ⅰ最适作用pH的测定 | 第25页 |
| 2.3.18 热稳定性突变株的筛选 | 第25-26页 |
| 3 实验结果 | 第26-43页 |
| 3.1 长枝木霉总RNA的提取 | 第26页 |
| 3.2 内切葡聚糖酶ⅠCDS片段的克隆 | 第26-27页 |
| 3.3 内切葡聚糖酶ⅠCDS片段的TA克隆 | 第27-28页 |
| 3.4 内切葡聚糖酶Ⅰ基因的生物信息学分析 | 第28-34页 |
| 3.4.1 基本信息学分析 | 第28-29页 |
| 3.4.2 相似性分析 | 第29页 |
| 3.4.3 亲水性分析 | 第29-30页 |
| 3.4.4 信号肽分析 | 第30-31页 |
| 3.4.5 糖基化位点的预测 | 第31-32页 |
| 3.4.6 保守结构域分析 | 第32-33页 |
| 3.4.7 内切葡聚糖酶Ⅰ三级结构预测 | 第33-34页 |
| 3.5 内切葡聚糖酶Ⅰ表达载体的构建 | 第34-35页 |
| 3.6 重组内切葡聚糖酶Ⅰ的诱导表达 | 第35-37页 |
| 3.6.1 PCR分析内切葡聚糖酶Ⅰ于毕赤氏酵母中的插入情况 | 第35页 |
| 3.6.2 甲醇诱导重组内切葡聚糖酶Ⅰ的表达 | 第35-36页 |
| 3.6.3 重组内切葡聚糖酶Ⅰ诱导表达的SDS-PAGE分析 | 第36-37页 |
| 3.7 诱导时间对重组内切葡聚糖酶Ⅰ分泌的影响 | 第37页 |
| 3.8 甲醇浓度对重组内切葡聚糖酶Ⅰ分泌的影响 | 第37-38页 |
| 3.9 内切葡聚糖酶Ⅰ的最适作用温度 | 第38页 |
| 3.10 内切葡聚糖酶Ⅰ的最适作用pH | 第38-39页 |
| 3.11 内切葡聚糖酶Ⅰ的随机突变 | 第39页 |
| 3.12 内切葡聚糖酶Ⅰ的基因重组 | 第39-41页 |
| 3.12.1 eg Ⅰ CDS的DNase Ⅰ酶解 | 第39-40页 |
| 3.12.2 无引物的重组 | 第40页 |
| 3.12.3 有引物的PCR | 第40-41页 |
| 3.13 热稳定性突变体的筛选 | 第41-43页 |
| 4 讨论 | 第43-50页 |
| 4.1 长枝木酶的纤维素酶 | 第43页 |
| 4.2 内切葡聚糖酶Ⅰ的结构与功能 | 第43-44页 |
| 4.3 纤维素酶在毕赤氏酵母中的表达 | 第44-46页 |
| 4.4 内切葡聚糖酶的定向进化 | 第46-47页 |
| 4.5 热稳定纤维素酶 | 第47-50页 |
| 5 结论与展望 | 第50-51页 |
| 参考文献 | 第51-59页 |
| 附录 | 第59-65页 |
| 附录一 实验仪器 | 第59-60页 |
| 附录二 试剂与培养基配方 | 第60-62页 |
| 附录三 试剂盒使用说明书 | 第62-64页 |
| 附录四 质粒图谱 | 第64-65页 |
| 致谢 | 第65页 |
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