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硫氧还蛋白融合表达系统表达的小鼠内皮抑素之纯化和生物学活性鉴定其它医学
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【中医学 论文下载】作者：马卫列,刘芳,何承伟,何振辉【关键词】 蛋白Purification of mouse endostatin in thioredoxin fusion expression system and identification of its biological activity
【Abstract】 AIM：To purify mouse endostatin by using thioredoxin fusion expression system and to identify its biological activity. METHODS: The pThioHisendo recombinant plasmid was transformed into BL21. After induction with IPTG, thioredoxinendo fusion protein was expressed in BL21 and the product was identified as inclusion body by SDSPAGE. The expression product was purified by affinity chromatography through Nicolumn. The purified protein was detected by chicken chorioallantoic membrane(CAM) angiogenesis inhibitory assay and endothelial cell proliferation inhibitory assay. RESULTS: High purity thioredoxinendostatin fusion protein was obtained by SDSPAGE analysis. The purity of the protein was over 95%. The protein possessed the inhibitory activity of endothelial cell proliferation and inhibited the angiogenesis of CAM ［inhibitory rate: (49.6±4.1)％, (53.2±2.3)％, (55.0±3.6)％ and (67.1±5.7)％］. CONCLUSION: The mouse endostatin recombinant fusion protein expressed in E.coli by using thioredoxin fusion expression system is easy to be purified and possesses high activity.
【Keywords】 endostatin；thioredoxin fusion expression system；fusion protein
【摘要】 目的：将硫氧还蛋白融合表达系统表达的小鼠内皮抑素（endostatin）进行纯化并对其生物学活性进行测定. 方法 ： 将含有pThioHisendo重组质粒转化大肠杆菌BL21，经IPTG（异丙基βD硫代半乳糖苷）诱导表达重组融合蛋白，SDSPAGE 分析 表达产物为包涵体，将包涵体纯化后通过镍柱亲和层析得到纯化的、可溶性的小鼠内皮抑素，经SDSPAGE分析鉴定. 将纯化的蛋白质通过鸡胚尿囊膜血管生成抑制实验和内皮细胞抑制实验对纯化的蛋白质进行生物学活性测定. 结果：经SDSPAGE电泳分析获得了高纯度的小鼠内皮抑素重组融合蛋白，纯度可达95%，得率为0.27 g/L. 纯化的重组蛋白在体外能抑制鸡胚囊膜血管生成及具有抑制血管内皮细胞增殖的活性，加入重组蛋白内皮抑素5 μg组与10 μg组血管生成抑制率分别为(22.3±2.0)％和(47.1±4.0)％，P<0.05，和对照组经过方差分析,差异都有显著性意义；内皮细胞抑制实验可见不同剂量重组蛋白内皮抑素对内皮细胞的生长具有抑制作用［抑制率分别为(49.6±4.1)％，(53.2±2.3)％，(55.0±3.6)％，(67.1±5.7)％］，经过方差分析和相关性分析，具有剂量依赖效应(r＝0.984，P<0.05). 结论： 用硫氧还蛋白融合表达系统在大肠杆菌中表达的小鼠内皮抑素重组融合蛋白易纯化并具有高活性.
【关键词】 内皮抑素；硫氧还蛋白融合表达系统；融合蛋白
0引言
内皮抑素（endostatin）是OReilly等［1］于1997年发现的一种血管生成抑制剂，相对分子质量Mr为20 000. Yamanaka等［2］实验发现，将含有内皮抑素基因的病毒注入小鼠脑瘤瘤体内可明显抑制肿瘤生长，减少瘤组织血管生成；刘江秋等［3］发现，重组血管内皮抑素能抑制小鼠黑色素瘤生长、转移及新生毛细血管的形成. 过去的抗癌药有较大的副作用，而内皮抑素通过与血管内皮细胞表面的整和素（integrin）结合抑制新生血管的形成［4］，控制肿瘤细胞的生长和转移，对正常细胞没有任何不良 影响 . 为了探讨内皮抑素用于肿瘤生物 治疗 的可行性，我们利用硫氧还蛋白融合表达系统在大肠杆菌中实现了对内皮抑素的高效表达，通过镍柱亲和层析对内皮抑素融合蛋白进行纯化，得到可溶性的内皮抑素融合蛋白，对纯化后的融合蛋白进行生物学活性鉴定，为以后大量生产及临床 应用 奠定基础.
1材料和方法
1.1材料硫氧还蛋白融合表达载体pThiohisA质粒由 中国 农业大学生物学院微生物系杨苏生教授惠赠；pThioHisAendo重组质粒由本室制备，Nickel Chelate Affinity Matrix(NiCAM)树脂购自Sigma公司，大肠杆菌BL21菌株为本室保存；甲叉双丙烯酰胺、溶菌酶、氧化型谷胱甘肽(GSSG)、还原型谷胱甘肽(GSH)、蛋白质标准Marker、脱氧胆酸钠、IPTG购自华美生物工程公司.
1.2方法
1.2.1实验分组①融合蛋白表达实验分为2组：加入IPTG至终浓度1 mmol/L的诱导组，诱导5 h；另一组为未加IPTG组. ②鸡胚囊膜（CAM）血管生成抑制实验分为3组：对照组（n=5），5 μg内皮抑素加样组（n=5），10 μg内皮抑素加样组（n=5）. ③内皮细胞抑制实验分为5组（每组n=5）：对照组，12.5，25，50和100 μg内皮抑素加样组.
1.2.2含目的基因的重组质粒pThioHisAendo融合蛋白的表达重组质粒转化感受态细菌：用0.1 mmol/L CaCl2处理BL21细菌，制备感受态细菌；加10 mg/L pThioHisendo重组质粒2 μL入100 μL感受态细菌中，冰浴30 min；42℃水浴热休克2 min，37℃水浴5 min，冰浴2 min；加1 mL不含氨苄的LB培养基，37℃水浴1 h. 取200 μL菌液涂布于含100 mg/L氨苄的LB平板上，37℃培养20 h. 融合蛋白表达的诱导：挑取单菌落接种于2 mL含氨苄的LB液体培养基中，37℃振荡培养过夜，共挑8个菌落，次日取20 μL菌液加入2 mL LB培养基，37℃培养至A590 nm为0.5左右.
1.2.3表达产物的鉴定取上述IPTG诱导5 h后的菌液10 μL，1000 r/min离心5 min，将沉淀弹匀，加入1 μL PMSF（苯甲基磺酰氟）、5 μL溶菌酶和1 g/L脱氧胆酸5 μL，不停摇动混匀，使细菌裂解，加1×106 U/L DNaseI 5 μL，混匀，37℃ 1 h，离心（4 ℃，12 000 g，15 min），沉淀为不溶解蛋白，上清即为可溶性蛋白，分别取上清液和沉淀，加入上样缓冲液，沸水浴5 min，用100 g/L SDSPAGE进行电泳， 2.5 g/L考马斯亮蓝R250染色，筛选阳性菌落. 电泳结束后确定融合蛋白为包涵体，5号和6号克隆表达最高.
1.2.4融合蛋白的提取①工程菌的发酵：取IPTG诱导5 h后的6号克隆菌液1.5 mL至2 L含氨苄的LB培养基中，37℃培养5 h左右至A590 nm为0.5，加入IPTG至终浓度1 mmol/L，诱导5 h，2500 g，4℃，离心8 min，收集诱导表达的菌体. ②包涵体的获得：细菌沉淀悬浮于200 mL bufferA（0.1 mol/L TrisCl pH 8.0，5 mmol/L EDTA），加入溶菌酶（50 mg/L），30℃放置15 min，加入1 g/L脱氧胆酸钠（SOC），超声破碎10 s，5次；8000 g，4℃离心10 min，弃上清，得包涵体. ③包涵体的洗涤：沉淀重悬于含1 g/L SOC的bufferA中，8000 g，4℃，离心10 min，弃上清；沉淀再次重悬于含1 g/L SOC的bufferA中洗涤，8000 g，4℃，离心10 min. ④包涵体的溶解：沉淀用30 mL bufferB（0.05 mol/L TrisCl pH 8.0，10 g/L十二烷基肌酸钠，1 mmol/L DTT）溶解，8000 g，4℃，离心10 min，取上清液. ⑤包涵体的透析和复性：上清转入截留相对分子质量Mr为8000的透析袋中，于1500 mL buffer C（0.05 mol/L TrisCl pH 8.0，0.1 mmol/L DTT）4℃透析4 h，再重复透析1遍；样品再次放入1500 mL buffer D（0.05 mol/L TrisCl pH 8.0）中透析4 h，2遍；样品再次放入1000 mL buffer E（0.05 mol/L TrisCl pH 8.0，0.01 mmol/L GSSG，1 mmol/L GSH）透析4 h，2遍. 最后样品放于0.05 mol/L TrisCl pH 8.0透析5 h，2遍. ⑥镍柱亲和层析进一步纯化内皮抑素融合蛋白：将40 mL（每毫升树脂可以纯化蛋白质20 mg） NiCAM亲和树脂（200 mL/L乙醇保存）装到层析柱里，用100 mL去离子水清洗树脂，再用150 mL平衡液（50 mmol/L磷酸钠pH 8.0，0.3 mol/L NaCl，10 mmol/L咪唑）冲洗，去除乙醇残留. 将待纯化的蛋白质溶液加到层析柱内树脂上，调节液体流出速度为25滴/min，并加平衡液冲洗. 待纯化的蛋白质溶液过柱完成后，继续用平衡液冲洗NiCAM亲和树脂层析柱，当过柱后的平衡液A280 nm保持稳定，接近平衡液本身的pH值时用洗脱液（50 mmol/L磷酸钠,pH 8.0，0.3 mol/L NaCl，250 mmol/L咪唑）洗脱含目的蛋白的NiCAM亲和树脂，收集含有目的蛋白的洗脱液. 考马斯亮蓝法测蛋白浓度， 计算 蛋白质获得率，再次SDSPAGE凝胶电泳，鉴定蛋白质纯度. 蛋白溶液保存于-20℃中，供活性测定使用.
1.2.5内皮抑素融合蛋白生物学活性的测定① CAM血管生成抑制实验：孵育7 d的受精鸡胚蛋壳开1 cm2左右的小窗口，将纯化的重组融合蛋白内皮抑素加样于放置在CAM上的灭菌滤纸上，在恒温恒湿培养箱培养48 h，取出鸡胚，局部用固定液固定，固定后剪下覆盖滤纸的CAM，弃去滤纸，把CAM置于干净的载玻片上，制成永久性标本. 在光学显微镜或解剖镜下随机选取5个视野， 计算 滤纸覆盖范围内可见的血管分支点的数量. 血管生成抑制率按下面的公式计算：血管生成抑制率（％）=(1－给药组血管分支点数/对照组血管分支点数) . ②内皮细胞抑制实验：体外培养人脐带静脉内皮细胞ECV304，传至5代后，调整细胞密度为1×108/L，接种于96孔板，每孔90 μL，常规培养4~6 h后弃上清，加入不同浓度培养液稀释的纯化蛋白10 μL/孔，对照组加入10 μL培养基，60 h后加入5 g/L MTT 20 μL/孔，继续孵育4 h，吸去上清加入DMSO 150 μL/孔，震荡10 min，在酶联免疫检测仪490 nm处读数.统计学处理： 本实验数据均采用x±s表示，SPSS 12.0评估版统计软件进行单因素方差 分析 和相关性分析，P<0.05表示差异有统计学意义.
2结果
2.1融合蛋白表达的鉴定SDSPAGE分析表明，含pThioHisAendo的工程菌经IPTG诱导后，表达产物在相对分子质量Mr约32×103处出现了1条明显的新蛋白带，其大小与 理论 推算的融合蛋白相对分子质量相符合（内皮抑素Mr为20×103，thioredoxin Mr为11.7×103），未经IPTG诱导的菌体实验组在相应位置没有明显表达（图1）. 上清和沉淀进行SDSPAGE凝胶电泳检测发现,thioredoxin/内皮抑素融合蛋白主要以包涵体形式存在于沉淀中，菌体裂解物上清在相应位置没有明确条带出现（图2）.
图1100 g/L SDSPAGE鉴定pThioHisAendo重组质粒在大肠杆菌BL21中的表达
图2100 g/L SDSPAGE电泳鉴定镍柱亲和层析纯化的硫氧还融合蛋白
2.2内皮抑素融合蛋白纯化结果的鉴定经过对包涵体的提取、溶解、复性、透析、镍柱亲和层析等步骤，内皮抑素融合蛋白被纯化，用考马斯亮蓝法测蛋白浓度为15.7 g/L，总体积为35 mL获得蛋白总量为0.55 g，得率为0.27 g/L菌液. 经过SDSPAGE凝胶电泳鉴定，在Mr约32×103处仅见1条目的蛋白区带，纯度可达95%（图1）.
2.3重组蛋白内皮抑素生物学活性对照组药物纸片覆盖范围内血管细小分支多(图3)；加入重组蛋白内皮抑素5 μg组（图4）和对照组相比，血管分支明显减少；加入重组蛋白内皮抑素10 μg组（图5）和对照组对比显示血管分支点进一步减少，根据表1统计学分析结果显示，血管生成抑制率明显高于重组蛋白内皮抑素5 μg组，两个实验组和对照组差异都有显著性差异(表1). 加入重组蛋白内皮抑素后，可见人脐带静脉内皮细胞生长受到明显抑制，不同浓度实验组抑制率见图6，并具有剂量依赖效应（r=0.984，P<0.05）.
图3鸡胚囊膜血管生成抑制实验（对照组）×40
图4鸡胚囊膜血管生成抑制实验（重组内皮抑素蛋白5 μg组）×40
3讨论
内皮抑素作为一种较强的血管生成抑制药， 治疗 图5鸡胚囊膜血管生成抑制实验（重组内皮抑素蛋白10 μg组）×40
表1重组蛋白内皮抑素对鸡胚绒毛尿囊膜血管生成的 影响 (略)
图6不同浓度的重组内皮抑素对脐静脉内皮细胞生长的抑制作用
肿瘤具有低毒、不产生耐药性等特点，因而备受关注. 重组内皮在美国已进入II期临床实验阶段，对多种肿瘤都有确切的治疗效果［5］. 用一般的大肠杆菌表达体系每升发酵液虽能得到30～40 mg纯内皮抑素，但99％未经正确折叠而无活性. 昆虫细胞和酵母细胞表达体系［6］虽能表达出有活性的蛋白质，每升发酵液仅能得到10 mg以下纯内皮抑素. 其构建过程复杂，产量小.为了高效、低成本制备内皮抑素，我们选用硫氧还蛋白融合蛋白表达系统，它特别适用于在大肠杆菌中高产量表达可溶性蛋白质. 本系统表达出的蛋白质大多能正确折叠并表现出全部生物学活性. 我们选用pThiohisA作为表达载体，它表达的硫氧还蛋白的特点是C－端有6个组氨酸残基，使重组蛋白可通过镍柱亲和层析技术得纯化. 我们利用硫氧还蛋白融合蛋白表达系统获得了高水平的thioredoxin/内皮抑素融合蛋白的表达，并经过包涵体的提取、纯化、溶解、复性及镍柱亲和层析纯化目的蛋白，得率为1升菌液可获得0.27 g纯化的内皮抑素融合蛋白，产量高于普通大肠杆菌表达体系4倍. 虽然本实验目的蛋白的表达仍是以包涵体形式存在，但也为重组蛋白纯化带来了极大的方便，这种高纯度、高活性目的蛋白的获取，便于 研究 其在抗肿瘤及其血管形成依赖性疾病中的治疗作用，为进一步用于临床奠定基础.
【 参考 文献 】
［1］ OReilly M S，Boehm T，Shing Y，et al. Endostatin：an endogenous inhibitor of angiogenesis and tumor growth［J］. Cell，1997,88:277-285.
［2］ Yamanaka B，Zullo SA，Ramsey J，et al. Induction of therapeutic antitumor antiangiogenesis by intratumoral injection of genetically engineered endostatin producing Semliki Forest virus ［J］. Cancer Gene The r，2001,8(10)：796-802.
［3］ 刘江秋，李忠义，陈林生，等. 重组人血管内皮抑制素抗肿瘤效应的 应用 研究［J］. 细胞与分子免疫学杂志，2001,17(1)：63-64.
［4］ Rehn M，Veikkola T，KukkValdre E，et al. Interaction of endostatin with integrins implicated in angiogenesis［J］. Proc Nat Acad Sci USA，2001,98（3）：1024-1029.
［5］ Capillo M，Mancuso P，Gobbi A，et al. Continuous infusion of endostatin inhibits，differentiation，mobilization and clonogenic potential of endothelial cell progenitors［J］. Clin Cancer Res，2003,9（1）：377-382.
［6］ Dhanabal M，Ramchandran R，Volk R，et al. Endostatin：yeast production，mutants，and antitumor effect in renal cell carcinoma［J］. Cancer Res，1999,59：189-197.
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