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应用细胞内PCR技术构建及筛选白癜风噬菌体抗体库其它医学
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【中药学论文】作者：刘玲，田艳丽，李春英，高天文【关键词】 白癜风；聚合酶链反应；噬菌体抗体库；自身抗体Construction and screening of human vitiligo phage autoantibody library based on incell PCR
【Abstract】 AIM: To obtain in situ pairing of the variable region genes of the heavy and light chains of vitiligo patients lymphocytes, then construct and screen a human ScFv phage antibody library. METHODS: We amplified in situ pairing of the variable region genes of the immunoglobulin heavy and light chains using the incell PCR together with Crerecombination, constructed and panned a human ScFv phage antibody library, and screened it with pigment cell suspension, then detected the activity of positive clones. RESULTS: We constructed an antibody library of 3×l06 in size, and obtained one specific autoantibody against melanocyte membrane antigens. CONCLUSION: Incell PCR together with human phage antibody library may be useful tools for the study of vitiligo antibody gene family and the VH/VL pairing that occurs during the autoimmune process.
【Keywords】 vitiligo; polymerase chain reaction; phage antibody library; autoantibodies
【摘要】 目的： 克隆白癜风患者淋巴细胞中原始配对的自身抗体基因，构建噬菌体抗体库并筛选针对黑素细胞膜抗原的特异性抗体. 方法 ： 细胞内PCR法扩增人免疫球蛋白轻链和重链可变区基因，Cre重组酶介导下完成单个细胞内的轻重链连接，获得反映体内原始配对信息的单链抗体可变区基因，构建噬菌体抗体库，筛选针对黑素细胞膜抗原的自身抗体. 结果： 构建完成库容量约为3×l06的噬菌体抗体库，筛选得到1株针对黑素细胞膜抗原的自身抗体. 结论： 利用细胞内PCR技术和噬菌体抗体库技术成功构建免疫文库，为进一步 研究 自身抗体在白癜风发生 发展 过程中的作用奠定了基础.
【关键词】 白癜风；聚合酶链反应；噬菌体抗体库；自身抗体
0引言
白癜风是一种常见的皮肤色素脱失性疾病，病因尚未完全明确，近年的研究倾向于自身免疫在黑素细胞破坏中发挥了重要作用. 患者体内存在包括抗黑素细胞抗体在内的多种自身抗体［1］. 抗黑素细胞抗体针对多种黑素细胞成分，其滴度与疾病活动性平行［2］，部分抗体针对细胞膜抗原，在黑素细胞破坏中有重要作用. 我们在前面的实验中已经摸索出细胞内PCR扩增抗体基因的方法，成功扩增患者体内原始亲本配对的自身抗体基因［3］，进一步结合噬菌体抗体库技术，构建免疫文库并筛选针对黑素细胞膜抗原的自身抗体，为研究血清中抗体对黑素细胞的作用奠定了基础.
1材料和方法
1.1样本白癜风患者均来自西京 医院 皮肤科门诊，诊断依据白癜风临床分型及疗效标准（2003修订稿）［4］，选择进展期、面积较大（皮损面积占体表面积5%以上）的患者，其中男48例，女52例；年龄12~55（平均21）岁；平均病程2 mo；所有患者采血前3 mo内未接受皮质类固醇、免疫调节药物、光化学等系统 治疗 .
1.2试剂免疫磁珠，CD19+单抗（BD Pharmingen公司），辣根过氧化物酶(HRP)标记羊抗人IgG和HRP标记羊抗鼠IgG（武汉博士德生物制品公司），蛋白酶K（Merck kGaA公司），PCR引物由赛百盛公司合成，Trizol和逆转录酶SuperScriptⅢ（Invitrogen公司），Cre重组酶（纽英伦生物公司），Taq酶和PCR产物回收纯化试剂盒（TaKaRa公司），限制性内切酶和T4 DNA连接酶（Promega公司），噬菌体表达载体PHENI由本校生化教研室雷迎峰博士惠赠，大肠杆菌XLBlue和含卡那霉素抗性的辅助噬菌体VCSM13由本实验室常规保存.
1.3扩增体内亲本配对的抗体基因
1.3.1分离CD19+B淋巴细胞常规培养人黑素细胞，活细胞ELISA法［5］筛选强阳性血清，抽取相应静脉血各15 mL,用淋巴细胞分离液按常规方法分离外周血单核细胞，免疫磁珠分离收集CD19+B淋巴细胞.
1.3.2扩增抗体基因按 文献 ［3］扩增人类主要的轻重链可变区基因，所有引物序列：5′GCTGCTGAGGGAGTAGAG 3′, 5′CAGATTTCAACTGCTCATCAGATGG 3′, 5′ATGGACTGGACCTGGAGGRTCYTCTKC 3′, 5′ATGGAGYTTGGGCTGASCTGGSTTTYT 3′, 5′TCATTCTCGACATAACTTCGTATAGCATACATTATACGAA GTTATAGAGCCGCCGCCGCCACTGCCGCCACCACCTGARGAGACRGTGACCRKKGTBCC 3′, 5′CTCGCAACTGCATAACTTCGTGCCATGGCCGMCATCCRGWTGACCCAGTCTCC 3′, 5′CTCGCAACTGCATAACTTCGTGCCATGGCCGATATTGTGATGACYCAGWCTCC 3′,5′CTCGCAACTGCATAACTTCGTGCCATGGCCGAAATTGTGWTGACRCAGTCTCC 3′, 5′GTCCTCGCAACTGCGGCCCAGCCGGCCTTGGCCCAGGTGCAGCTGSWGSAGTCWGG 3′, 5′GAGTCATTCTCGACTTGCGGCCGCTCGTTTGATYTCCASCTTGGTCCC 3′, 5′GAGTCATTCTCGACTTGCGGCCGCTCGTTTGATATCCACTTTGGTCCC 3′, 5′GAGTCATTCTCGACTTGCGGCCGCTCGTTTAATCTCCAGTCGTGTCC C 3′, 5′CAGATTT CAACTGCTCATCAGATGG 3′.（SfiI位点CCG GCC TTG GCC；NotI位点TGC GGC CGC. 引物中的简并碱基符号K=G/T, M=A/C, R=A/G, S=C/G, W=A/T, Y=C/T, B=C/G/T, D=A/G/T, H=A/C/T, V=A/C/G）. PCR1反转录、分别扩增轻链和重链可变区基因，Cre酶重组后PCR2及PCR3扩增反映体内原始装配的抗体基因，各步PCR反应条件均优化为95℃ 30 s, 57℃ 40 s, 72℃ 1 min.
1.4构建ScFv噬菌体抗体库纯化的ScFv基因产物，经SfiI和NotI双酶切，与同样双酶切回收的PHENI载体大片段连接，电转化XLBlue感受态菌，37 ℃ 100 r/min振荡1 h，取适量菌液铺于Amp阳性的LB琼脂平板，37℃数菌落 计算 库容，并挑单菌落提取质粒，酶切鉴定抗体库的重组率. 其余菌液转入含氨苄青霉素(100 mg/L)的SB培养液，37℃振荡1 h，加入四环素(10 mg/L), 37℃振荡1 h，按1×l012 cfu/mL加入辅助噬菌体VCSM13, 37℃振荡2 h后加入卡那霉素(70 mg/L), 37℃振荡过夜. 次日，收集菌液4℃ 5000 r/min离心15 min，收集上清，加PEG8000至40 g/L, NaCl至30 g/L，冰浴中沉淀30 min, 4℃ 8000 r/min离心30 min，弃上清，10 g/L BSA 10 g/L甘油PBS溶解沉淀，12 000 r/min离心，上清即为噬菌体抗体库，-20℃保存.
1.5筛选噬菌体抗体库参照文献［6］，以完整的黑素细胞为抗原对噬菌体抗体库进行4轮富集筛选. 2×107个细胞洗涤离心，30 g/L BSAPBS 1 mL, 37℃封闭1 h，弃封闭液，加噬菌体抗体库液1 mL, 37℃缓慢颠倒吸附2 h. 离心弃上清，PBS洗涤（第一轮洗2次，以后每轮洗20次），加入对数期生长的XLBlue菌液2 mL, 37℃振荡培养30 min，取适量铺盘计算回收率，其余转入三角烧瓶，加SB至总体积10 mL，37℃振荡培养1 h，加入70 mL SB培养液和AMP（100 mg/L），于37℃振荡培养至对数生长期；加1×l012 cfu VCSM13诱导表达，30℃振荡培养过夜. 次日将菌液离心收集上清，浓缩后得到次级库，反复筛选4轮.
1.6噬菌体抗体的表达和特异性检测
1.6.1噬菌体抗体的表达从第3轮和第4轮筛选后的培养皿上分别随机挑取40个菌落各加入到1.5 mL LB培养液中(Amp 100 mg/L, Kan 25 mg/L)中，37℃振荡培养过夜. 补加1.5 mL LB，振荡培养1 h，加入50 μL VCSM13，30℃振荡培养过夜. 次日，菌液离心上清即为初步筛得的噬菌体抗体.
1.6.2抗体特异性的细胞ELISA检测将黑素细胞接种于96孔培养板上，待贴壁生长后，PBS洗涤加入30 g/L的BSAPBS（300 μL/孔），37℃封闭1 h. 弃去封闭液，加入待测噬菌体抗体（50 μL/孔），37℃孵育1 h. 用0.5 mL/L Tween20PBS洗涤3次，加HRP抗M13抗体（工作浓度1∶5000, 50 μL/孔），37℃孵育1 h. 0.5 ml/L Tween20PBS洗涤5次后显色，于波长490 nm测定A值. 显色阳性的克隆再以黑素瘤细胞系LiBr，375，角质形成细胞、成纤维细胞和角蛋白等为抗原鉴定抗原抗体反应的特异性.
2结果
2.1扩增ScFv基因细胞内PCR扩增ScFv基因，电泳目的条带约为800 bp，与预期大小相符（图1）.
M: Marker (DL2000).
图1细胞内PCR扩增ScFv基因（略）
2.2构建噬菌体抗体库构建的噬菌体抗体库库容约为3×l06，挑20个单菌落提质粒进行SfiI和NotI双酶切、琼脂糖凝胶电泳，19个见800 bp左右目的条带，重组率为95%（图2）.
2.3筛选噬菌体抗体库用黑素细胞对噬菌体抗体库进行亲和吸附筛选，经过4轮筛选，特异性噬菌体抗体逐渐富集，到第4轮回收率增加约67倍(表1).
M: Marker (DL 2000).
图2噬菌体抗体库重组 分析 ，显示SfiI和NotI双酶切后的阳性克隆（略）
表1每轮筛选噬菌体抗体库的投入产出比（略）
2.4抗体特异性的ELISA检测随机挑取80个单菌落制备噬菌体抗体，ELISA检测到1株可与黑素细胞结合，而与黑素瘤细胞系LiBr，375，角质形成细胞、成纤维细胞和角蛋白等无关抗原反应呈阴性.
3讨论
早在20世纪80年代，国外学者就发现白癜风与自身免疫有密切关系，开始了对白癜风自身抗体的 研究 . Bystryn等［7］发现，白癜风患者体内存在多种抗体，除针对黑素细胞胞浆和胞膜抗原的抗体外，还检测到针对角质形成细胞或其他普通组织抗原的抗体，相当数量的白癜风患者合并有甲状腺功能不全，部分患者可以检测到甲状腺自身抗体［8］. 我们通过活细胞ELISA法、Western blotting，免疫组化、免疫荧光等多种 方法 证实，白癜风患者体内存在抗黑素细胞膜自身抗体，主要为IgG抗体，滴度与疾病活动性相关，此类抗体直接针对黑素细胞膜表面抗原导致黑素细胞破坏，进一步释放酪氨酸酶及相关蛋白等胞浆抗原，产生更多自身抗体引起损伤［5，9］. 但自身抗体在疾病发生中究竟是始动因素还是继发反应，也一直存在争议，因此有必要深入研究白癜风自身抗体，特别是针对黑素细胞膜抗原的特异性抗体.
20世纪90年代开始出现的噬菌体抗体库技术是抗体研究和制备方面的重大突破， 应用 于寻常型天疱疮、系统性红斑狼疮、Grave病等自身免疫性疾病和病毒感染性疾病，已经筛选得到疾病相关性自身抗体［10-12］. 但传统方法构建的抗体库，是将大量的细胞混合，反转录分别扩增轻链基因和重链基因，得到的扩增产物是多种轻链基因的混合产物和多种重链基因的混合产物，混合产物再随机组合到噬菌体载体. 最终同一个载体上的轻链与重链的配对是人工随机组合的，而不是在体内时的原始配对，无法反映患者体内抗体的原始配对情况. 为解决这一 问题 ，我们引入细胞内PCR技术扩增抗体可变区基因. 细胞内PCR技术是一种全新的扩增抗体可变区基因的方法，通过固定通透化外周血淋巴细胞，以一组引物直接在细胞内部扩增抗体轻、重链基因并装配成单链抗体，可以获知编码体内原始轻、重链配对抗体基因的准确信息，从分子水平上阐述致病性自身抗体的产生机制、编码基因的 规律 和基因突变特点［13-14］. 本研究结合细胞内PCR技术和噬菌体抗体库技术，从人免疫细胞中扩增体内亲本配对的单链抗体可变区基因，克隆到噬菌体载体，同时以融合蛋白的形式表达在噬菌体外壳表面，利用完整细胞筛选特异性针对黑素细胞膜抗原的自身抗体，从而得到编码疾病相关抗体基因的准确信息.
研究中筛选血清抗体滴度高的白癜风患者，因其B细胞已经对黑素细胞抗原产生体液免疫应答，抗体在体内经过抗原选择、可变区基因重排和亲和力成熟，产生特异性和亲和力较好的目的抗体. 本实验经细胞内PCR成功克隆白癜风自身抗体基因，构建完成库容量3×l06,重组率95%的免疫库. 白癜风发病过程中，直接针对黑素细胞膜表面抗原的自身抗体扮演了重要角色，因此以完整黑素细胞为抗原，通过4轮"亲和吸附洗脱扩增"筛选，获得1株特异性针对黑素细胞膜抗原的抗体. 该抗体基因反映体内原始的轻重链搭配，进一步探索其性能和生物学作用，可能为白癜风发病机制的研究提供新思路.
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