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疏肝健脾方药对非酒精性脂肪性肝病大鼠肝细胞PI3K p85α蛋白表达
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【制西药论文】作者：杨钦河 欧健 孙升云 乔娜丽 程少冰 陈万群 金玲 杨环文 李娜 纪桂元 谢维宁 林秀峰 张玉佩 薛川松 【摘要】 目的 观察疏肝健脾方药对非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）大鼠肝细胞磷脂酰肌醇3激酶p85α(PI3K p85α)表达的影响。方法 以高脂饮食12周建立大鼠NAFLD模
作者：杨钦河 欧健 孙升云 乔娜丽 程少冰 陈万群
金玲 杨环文 李娜 纪桂元 谢维宁 林秀峰 张玉佩 薛川松
【摘要】 目的 观察疏肝健脾方药对非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）大鼠肝细胞磷脂酰肌醇3激酶p85α(PI3K p85α)表达的影响。方法 以高脂饮食12周建立大鼠NAFLD模型后，造模组大鼠再随机分为模型组、疏肝组、健脾组、综合组和自然恢复组等5组。治疗组分别给予相应药物灌胃，其他组给予等量蒸馏水灌胃，模型组继续高脂饮食，其余均予基础饲料喂养。治疗8周后，用3%戊巴比妥腹腔麻醉，腹主动脉取血，全自动生化仪检测血脂及肝功，稳态模型法评价胰岛素抵抗程度，光镜下观察各组肝脏病理改变，免疫组化方法检测肝细胞内PI3K p85α蛋白的表达情况。结果 与模型组相比，药物治疗各组及自然恢复组肝脏脂变程度明显减轻，肝功、血脂、胰岛素抵抗均有显著改善（P<0.05或P<0.01），肝细胞内PI3K p85α蛋白的表达明显减少（P<0.05）。与自然恢复组相比，药物治疗各组肝功、血脂、血糖的改善无显著差异，但肝脏脂变程度减轻，胰岛素抵抗指数明显下降（P<0.05），肝细胞内PI3K p85α蛋白的表达显著降低（P<0.05）。结论 疏肝健脾方药对高脂饮食诱导的大鼠NAFLD有较好的治疗作用，其机制可能是与其降低肝细胞PI3K p85α的表达有关。
【关键词】 非酒精性脂肪性肝病 胰岛素抵抗 PI3K p85α 疏肝健脾方药
非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）是目前临床上的常见病和多发病，严重影响和威胁着人们的健康。目前认为，它是遗传环境代谢相关性疾病，与中心性肥胖、脂质代谢紊乱、2型糖尿病等代谢综合征疾病密切相关［1］。其发病尚不能以单一的机制解释,可能为多途径、多层次损伤产生的结果，胰岛素抵抗(IR)也被认为是其重要的发病基础。以往的研究发现，疏肝、健脾方药抗脂肪肝作用的效果显著［2,3］。本实验从胰岛素抵抗方面入手探讨上述方药治疗NAFLD的作用效果及其机制。
1 材料和方法
1.1 实验动物
SPF级雄性SD大鼠65只，购自广州中医药大学实验动物中心。实验动物许可证号：SCXK（粤）2005－2004，粤监证字：2007A010，体质量（200±20）g。
1.2 实验药物
柴胡疏肝散：柴胡6 g，川芎5 g，枳壳5 g，陈皮6 g，白芍5 g，香附5 g，炙甘草3 g。参苓白术散：人参15 g，白术15 g，茯苓15 g，薏苡仁9 g，砂仁6 g，山药15 g，桔梗6 g，白扁豆12 g，莲子9 g，炙甘草9 g。以上方药组成、剂量均参照方剂学［4］。上述药物均为三九制药颗粒剂，购自暨南大学附属第一医院中药房。
1.3 饲料
基础饲料购自广东省实验动物中心，高脂饲料的组成为83%基础饲料，10%猪油，5%蔗糖，1.5%胆固醇，0.5%胆盐。
1.4 实验试剂
游离脂肪酸（FFA）试剂盒购于南京建成生物工程研究所，胰岛素放免试剂盒购于中国原子能科学研究院同位素研究所，PI3K p85α一抗（兔抗大鼠）及二抗工作液（羊抗兔IgG）购于武汉博士德生物技术公司。
1.5 动物分组与模型建立
大鼠正常喂养1周后，随机分为正常组（10只）、造模组（55只）。正常组给予基础饲料喂养，造模组给予高脂饲料喂养。12周后，随机抽取造模组5只，取肝组织做病理检测。鉴定造模成功后，将造模组随机分为模型组、疏肝组(柴胡疏肝散)、健脾组(参苓白术散)、综合组（柴胡疏肝散合参苓白术散）、自然恢复组，每组10只，用药组灌药剂量据《现代医学实验动物学》［5］确定，其余各组均给予等量蒸馏水灌胃，同时除模型组继续高脂饮食外，其余均予基础饲料喂养。治疗8周后，各组动物于末次给药后,禁食不禁水12 h，用3%戊巴比妥腹腔麻醉，经腹主动脉取血，分离血清，迅速摘取肝脏，取相同部位肝右叶组织用多聚甲醛溶液固定。
1.6 指标检测
1.6.1 生化指标 用全自动生化检测仪检测血清ALT、AST、TC、TG、LDLC、HDLC、GLU、ApoB100，用FFA检测试剂盒检测血清FFA，血清胰岛素的测定采用放射免疫法。胰岛素抵抗指数（HOMAIR）=空腹胰岛素（μU/mL）×空腹血糖（mmol/L）/22.5，计算值取自然对数变换。
1.6.2 组织病理学检查 取固定液固定的肝组织，大小约2 cm×2 cm×0.3 cm，常规石蜡包埋，切片，HE 染色，光镜下观察肝脏组织学变化。
1.6.3 肝细胞内PI3K p85α的检测 肝组织石蜡切片用免疫组化（SABC法）方法检测PI3K p85α在肝细胞中的表达及分布情况。
1.7 统计学方法
计量资料以（±s）表示，组间比较采用单因素方差分析，PI3K p85α阳性率的比较用χ2检验及Fisher’s确切概率检验。 P＜0.05有统计学意义。所有数据均采用SPSS13.0统计软件进行统计分析。
2 结果
2.1 各组大鼠血清TC、TG、HDLC、LDLC的变化
与正常组相比，模型组TC、TG、LDLC较正常组显著升高（P＜0.01），HDLC显著降低（P＜0. 05）；与模型组相比，各药物治疗组及自然恢复组均显著降低TC、LDLC（P＜0.01）及TG（P＜0. 05），升高HDLC（P＜0.05），提示调整饮食结构可能对NAFLD的早期具有重要意义。见表1。
2.2 各组大鼠血清ALT、AST、FFA和ApoB100的变化
与正常组相比，模型组ALT、AST、ApoB100均显著升高（P＜0.01），FFA明显增加（P＜0.05）；与模型组相比，药物治疗组及自然恢复组ALT、AST、FFA均显著降低（P＜0.01，P＜0.05）；药物治疗各组ApoB100显著降低（P＜0.01），提示疏肝健脾方药可能对脂质代谢具有进一步的潜在作用。见表2。
2.3 各组大鼠空腹血糖、胰岛素及胰岛素抵抗指数的变化
与正常组比较，模型组血糖、胰岛素及胰岛素抵抗指数均显著升高（P＜0.05）。与模型组相比，各用药治疗组及自然恢复组均可显著降低血糖、胰岛素及胰岛素抵抗指数（P＜0.05）。与自然恢复组相比，药物治疗组胰岛素、胰岛素抵抗指数均有明显降低（P＜0.05），提示所造大鼠NAFLD模型存在IR。见表3。
表1 各组大鼠血脂的变化（略） Table 1 Comparison of the levels of blood lipid in different groups 与正常组相比:*P＜0.05, **P＜0.01；与模型组相比:▲P＜0.05，▲▲P＜0.01 表2 各组大鼠肝功、FFA和ApoB100的
表1 各组大鼠血脂的变化（略）
Table 1 Comparison of the levels of blood lipid in different groups
与正常组相比:*P＜0.05, **P＜0.01；与模型组相比:▲P＜0.05，▲▲P＜0.01
表2 各组大鼠肝功、FFA和ApoB100的变化（略）
Table 2 Comparison of the levels of serum ALT, AST, FFA and ApoB100 in different groups
与正常组相比:*P＜0.05，**P＜0.01；与模型组相比:▲P＜0.05，▲▲P＜0.01
表3 各组大鼠空腹血糖、胰岛素及胰岛素抵抗指数的变化（略）
Table 3 Comparison of FPS, insulin and insulin resistance index in different groups
与正常组相比:*P＜0.05；与模型组相比:▲P＜0.05；与自然恢复组相比:★P＜0.05
2.4 各组大鼠肝组织学变化
大体观察：模型组大鼠肝脏体积明显增大，包膜紧张，色泽较正常组暗淡，整体呈苍黄色，可见局灶黄白色变性灶，质地偏硬，切面油腻。其他各组大鼠肝体积均有不同程度的增大，呈淡黄褐色，质地、弹性和韧性均较正常组略差。其中，疏肝组、健脾组、综合组要好于自然恢复组。
光镜下正常组大鼠肝脏肝小叶结构清晰，细胞索排列整齐。模型组大鼠肝小叶界限不清，肝细胞索排列紊乱，肝窦消失，出现弥漫性脂肪变性，胞浆中可见大小、数量不一的脂滴空泡，甚者脂滴互相融合，将胞核挤向一侧；小叶内炎症较重，部分大鼠可见数个炎症坏死融合成片。
疏肝组、健脾组、综合组病理改变大致相同，表现为肝细胞轻度脂肪变。自然恢复组大鼠肝组织脂肪变程度较模型组明显减轻，但不如其他药物治疗组改善明显。
2.5 各组大鼠肝细胞PI3K p85α蛋白表达及分布情况
2.5.1 PI3K p85α的免疫组化结果 正常组大鼠肝细胞内PI3K p85α表达很少，阳性表达率低；模型组大鼠肝细胞内PI3K p85α的表达强，阳性细胞染色呈黄褐色，主要分布于脂肪变的肝细胞膜和胞浆内，阳性表达率高达90%；其他各组PI3K p85α表达强度依次为自然恢复组＞综合组＞健脾组＞疏肝组，其中药物治疗组染色强度相似，主要分布在脂肪变肝细胞的阳性细胞率逐渐降低。与正常组相比，模型组PI3K p85α表达显著增多（P＜0. 05）；与模型组比较，各药物治疗组PI3K p85α表达显著减少（P＜0.05），以疏肝组PI3K p85α表达降低最明显，自然恢复组PI3K p85α表达也降低，但差异无统计学意义，提示疏肝健脾方药有显著抑制PI3K p85α表达的作用。见表4及图1。
表4 各组大鼠肝细胞PI3K p85α表达比较（略）
Table 4 Comparison of the expression of PI3K p85α in hepatocyte in different groups
与模型组相比:*P＜0.05
A.正常组（×400）;B.模型组（×400）;C.疏肝组（×400）;D.健脾组（×400）;E.综合组（×400）;F.自然恢复组（×400）
图1 各组大鼠肝细胞PI3K p85α的表达情况(SABC法)（略）
Figure 1 The expression of PI3K p85αprotein in hepatocyte in different groups
2.5.2 PI3K p85α的表达与病理分级的关系
χ2检验相关分析表明，PI3K p85α在各组中的表达强度与其病理分级存在正相关（相关系数r=0.671，P=0.000），提示肝组织脂肪变性程度越严重PI3K p85α的表达越强，二者存在明显的相关性。见表5。
表5 肝组织脂肪变性程度与PI3K p85α表达的相关性（略）
Table 5 Correlation between degree of liver steatosis and expression of PI3K p85α
3 讨论
NAFLD是遗传、环境、代谢因素所致肝细胞脂肪变性为主的临床病理综合征。大量流行病学资料显示，NAFLD与肥胖、2型糖尿病(T2DM)、血脂异常等代谢综合征相关疾病密切相关。由于IR是代谢综合征的“共同土壤”［6］，故而推测IR可能也是NAFLD的发病基础。最近研究表明，几乎所有的NAFLD患者都存在周围组织和肝脏的IR ［7］，且IR的严重程度与NAFLD的病情进展相关［8,9］。
研究表明高脂环境诱导的IR伴有胰岛素信号传递通路多个环节表达或活性的异常［10,11］。肝细胞内的胰岛素信号转导通路主要是PI3K信号通路，胰岛素受体后信号转导通路异常是导致IR的最主要的原因。PI3K的改变与IR密切相关。PI3K是脂质激酶的一种，在介导胰岛素刺激的糖代谢反应过程中具有重要的作用。PI3K是由一个分子量85 kDa的调解亚基（p85）和一个分子量110 kDa的催化亚基（p110）组成的异二聚体复合物。p85α是p85表达最丰富的一个亚基。过度表达的PI3K p85亚基能够竞争性抑制p85p110二聚体与胰岛素受体底物1（IRS1）的结合，从而抑制PI3K的活性［11,12］。相反，部分抑制p85亚基表达，提高p85p110二聚体/ p85单体的比例可以改善PI3K介导的胰岛素信号转导［13］， p85α过度表达是营养诱导IR发病机制中一个早期分子步骤［14］。在本实验中，模型组大鼠肝组织中PI3K p85α蛋白的表达明显高于正常组，因此可认为，p85α的表达增多，导致p85与p110比值明显增加，使PI3K的活性下降，从而导致IR的发生，进而引起全身脂质代谢紊乱，脂肪在肝脏的堆积增加。本实验研究表明，模型组大鼠肝指数、肝功、血脂、血糖、胰岛素及IR指数显著升高，说明高脂饮食20周诱导的NAFLD模型存在严重的糖脂代谢紊乱，并出现了IR，与文献报道的结果一致［15］。
与控制高脂饮食治疗相比，疏肝健脾方药联合控制高脂饮食方案治疗NAFLD，对血脂、肝功、血糖的改善作用无明显提高，但在改善IR程度及肝组织病理方面，疏肝健脾方药显示出了良好的作用，其效果明显优于单纯的控制高脂饮食，且其可明显减少肝细胞PI3K p85α蛋白的表达。笔者认为，控制饮食结构的治疗可通过降低血脂、血糖来减轻甚至消除IR，若肝损伤只停留在单纯性脂肪肝阶段，去除外部损伤因素后，肝脏有较强的自身调节、自我恢复的作用；但是疏肝健脾方药能显著减少肝细胞PI3K p85α蛋白的表达，改善IR，说明在NAFLD的中早期，通过控制高脂饮食固然可以降低血糖、血脂，但其改善胰岛素抵抗未起到根本性的作用，疏肝健脾法及其方药能针对胰岛素抵抗的发病机制，充分发挥中医整体综合治疗的优势，以达到改善IR、增加胰岛素敏感性的目的，其具体的作用机制值得进一步研究。
中医学认为肝失疏泄,气机不畅,或脾不健运,水湿内停,湿热内蕴,痰浊郁结,痰瘀阻滞,最终形成湿浊痰瘀互结,痹阻肝脏脉络而形成本病。可见肝郁脾虚是发病的内在基础,湿浊痰瘀为主要病理因素，本虚标实为其病机特点，肝郁脾虚的病机贯穿于NAFLD发病过程的始终［16］。研究发现，肝气郁滞以及在脾虚的基础上，水湿、痰浊、瘀血内生，是IR产生的主要病理机制［17］。根据以方测证的原理，所造大鼠NAFLD模型的中医证候应属肝郁脾虚向痰湿内阻进而痰瘀互结阶段转化，其证候究竟是如何发展转化的，尚需进一步探讨。
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