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解淀粉芽孢杆菌转录组学及其表达元件的挖掘与应用
 
     论文目录
 
摘要第5-7页
Abstract第7-8页
英文缩略词表第15-17页
第一章 绪论第17-46页
    1.1 转录组学第17-27页
        1.1.1 转录组学研究概况第17-18页
        1.1.2 转录组学研究方法第18-22页
        1.1.3 原核生物的转录组学研究第22-25页
        1.1.4 芽孢杆菌属的转录组学研究第25-27页
    1.2 芽孢杆菌属的表达元件第27-37页
        1.2.1 芽孢杆菌属中启动子结构第27-31页
        1.2.2 启动子的筛选第31-36页
            1.2.2.1 启动子的预测第31-32页
            1.2.2.2 启动子探针系统第32-34页
            1.2.2.3 构建启动子文库第34-36页
        1.2.3 核糖体结合位点第36-37页
    1.3 鸟苷生产菌的代谢工程研究第37-44页
        1.3.1 鸟苷生产菌第37-38页
        1.3.2 鸟苷的生物合成途径第38-42页
        1.3.3 鸟苷产生菌的代谢工程改造第42-44页
    1.4 本课题的研究意义及主要内容第44-46页
        1.4.1 本课题的研究意义第44-45页
        1.4.2 本课题的研究内容第45-46页
第二章 基于RNA-seq技术的解淀粉芽孢杆菌转录组学研究第46-76页
    2.1 引言第46页
    2.2 实验材料与方法第46-49页
        2.2.1 主要仪器和设备第46-47页
        2.2.2 菌种和质粒第47页
        2.2.3 主要试剂第47页
        2.2.4 培养基与溶液的配制第47-48页
            2.2.4.1 培养基的配制第47-48页
            2.2.4.2 溶液的配制第48页
        2.2.5 所用引物序列第48-49页
    2.3 实验方法第49-60页
        2.3.1 细菌的培养第49页
            2.3.1.1 大肠杆菌的培养第49页
            2.3.1.2 芽孢杆菌的培养第49页
        2.3.2 质粒的构建第49-54页
            2.3.2.1 pBEP43-bgaB质粒的构建第49-54页
            2.3.2.2 整合质粒pKS2-amyX的构建第54页
        2.3.3 解淀粉芽孢杆菌的转化第54-55页
            2.3.3.1 电击感受态细胞的制备第54页
            2.3.3.2 感受态细胞的电击转化第54-55页
        2.3.4 RNA-seq测序菌株XH7-bgaB的构建第55-56页
        2.3.5 RNA-seq样品的制备第56-57页
        2.3.6 cDNA建库及测序第57-58页
        2.3.7 测序数据的组装和拼接第58页
        2.3.8 基因表达水平及标准化第58-59页
            2.3.8.1 基因表达水平第58-59页
            2.3.8.2 基因表达水平的标准化第59页
        2.3.9 RNA-seq数据的生物信息学分析第59页
        2.3.10 RT-qPCR验证RNA-seq数据的分析结果第59-60页
    2.4 结果与讨论第60-74页
        2.4.1 RNA样品的制备与分析第60-62页
        2.4.2 解淀粉芽孢杆菌RNA-Seq数据的概述第62-63页
        2.4.3 解淀粉芽孢杆菌全基因组水平的转录分析第63-65页
        2.4.4 RT-qPCR验证分析RNA-Seq数据第65-66页
        2.4.5 基因转录起始位点和转录终止位点的研究第66-67页
        2.4.6 操纵子结构的研究第67-68页
        2.4.7 与鸟苷代谢相关途径的分析第68-74页
    2.5 本章小结第74-76页
第三章 解淀粉芽孢杆菌表达元件的挖掘第76-101页
    3.1 引言第76页
    3.2 实验材料与方法第76-83页
        3.2.1 主要仪器和设备第76-77页
        3.2.2 菌种和质粒第77-79页
        3.2.3 主要试剂第79-80页
        3.2.4 培养基与溶液的配制第80-81页
            3.2.4.1 培养基的配制第80页
            2.2.4.2 溶液的配制第80-81页
        3.2.5 所用引物序列第81-83页
    3.3 实验方法第83-90页
        3.3.1 菌体的培养第83页
            3.3.1.1 大肠杆菌的培养第83页
            3.3.1.2 解淀粉芽孢杆菌的培养第83页
        3.3.2 质粒的构建第83-84页
            3.3.2.1 表达质粒的构建第83-84页
            3.3.2.2 启动子探针质粒pBE-bgaB的构建第84页
        3.3.3 筛选启动子第84-87页
        3.3.4 筛选的启动子序列分析和生物信息学分析第87页
        3.3.5 启动子的亚克隆第87-88页
        3.3.6 芽孢杆菌的转化第88页
        3.3.7 蛋白样品制备与SDS-PAGE电泳检测第88-90页
    3.4 结果与讨论第90-100页
        3.4.1 基于RNA-Seq数据筛选强启动子研究第90-93页
            3.4.1.1 强启动子分类及活性鉴定分析第90-92页
            3.4.1.2 筛选的强启动子的表达运用研究第92-93页
        3.4.2 启动子探针质粒筛选启动子研究第93-100页
            3.4.2.1 启动子探针质粒的构建情况第93-94页
            3.4.2.2 具有 β-半乳糖苷酶活性转化子的筛选研究第94-96页
            3.4.2.3 筛选的强启动子在解淀粉芽孢杆菌中的 β-Gal活力研究第96-97页
            3.4.2.4 筛选的P41强启动子的序列分析第97-98页
            3.4.2.5 P41启动子的RBS位点优化研究第98-100页
    3.5 本章小结第100-101页
第四章 嘌呤操纵子表达元件的基因工程改造研究第101-126页
    4.1 引言第101页
    4.2 实验仪器和材料第101-105页
        4.2.1 主要仪器设备第101-102页
        4.2.2 菌种和质粒第102页
        4.2.3 主要试剂第102-103页
        4.2.4 培养基与溶液的配制第103-104页
            4.2.4.1 培养基的配制第103页
            4.2.4.2 溶液的配制第103-104页
        4.2.5 所用引物序列第104-105页
    4.3 实验方法第105-112页
        4.3.1 解淀粉芽孢杆菌的摇瓶发酵第105页
        4.3.2 嘌呤操纵子启动子 5’-UTR截断载体的构建第105-106页
        4.3.3 嘌呤启动子替换质粒的构建第106-108页
        4.3.4 嘌呤启动子表达载体的构建第108页
        4.3.5 解淀粉芽孢杆菌转化株的敲除过程第108-109页
        4.3.6 解淀粉芽孢杆菌转化株的筛选与鉴定第109-110页
        4.3.7 发酵液中鸟苷产量的测定第110页
        4.3.8 发酵液中葡萄糖含量的测定第110页
        4.3.9 发酵液中菌体干重的测定第110页
        4.3.10 发酵液中胞内物质的测定第110-111页
        4.3.11 发酵过程中RNA的提取与检测第111页
        4.3.12 实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测第111-112页
    4.4 结果与讨论第112-124页
        4.4.1 解淀粉芽孢杆菌嘌呤操纵子的启动子结构分析第112页
        4.4.2 嘌呤操纵子启动子 5’-UTR截短载体的构建情况第112-114页
        4.4.3 嘌呤启动子替换载体的构建情况第114-116页
        4.4.4 嘌呤启动子表达载体的构建情况第116-117页
        4.4.5 嘌呤操纵子启动子活性的比较分析第117-118页
        4.4.6 解淀粉芽孢杆菌的转化及工程菌的鉴定分析第118-120页
            4.4.6.1 5’-UTR截短工程菌的获得及鉴定分析第118-119页
            4.4.6.2 嘌呤启动子替换工程菌的获得及鉴定分析第119-120页
        4.4.7 工程菌的鸟苷摇瓶发酵情况第120-121页
        4.4.8 工程菌的胞内物质的检测分析第121-123页
        4.4.9 工程菌发酵过程中嘌呤操纵子的表达研究第123-124页
    4.5 本章小结第124-126页
第五章 解淀粉芽孢杆菌呼吸链的基因工程改造研究第126-139页
    5.1 引言第126-127页
    5.2 实验材料与方法第127-128页
        5.2.1 主要仪器设备第127页
        5.2.2 菌种和质粒第127页
        5.2.3 主要试剂第127页
        5.2.4 培养基与溶液配制第127-128页
            5.2.4.1 培养基的配制第127-128页
            5.2.4.2 溶液的配制第128页
        5.2.5 所用引物序列第128页
    5.3 实验方法第128-131页
        5.3.1 解淀粉芽孢杆菌的培养第128页
        5.3.2 cyd操纵子敲除载体pKS2-cyd的构建第128-129页
        5.3.3 解淀粉芽孢杆菌的转化第129页
        5.3.4 解淀粉芽孢杆菌△cyd工程菌的构建第129页
        5.3.5 解淀粉芽孢杆菌△cyd工程菌的筛选与鉴定第129页
        5.3.6 发酵液中鸟苷含量的测定第129页
        5.3.7 发酵液中葡萄糖含量的测定第129页
        5.3.8 发酵液中菌体干重的测定第129页
        5.3.9 发酵液中有机酸的测定第129-130页
        5.3.10 工程菌遗传稳定性实验第130-131页
    5.4 结果与讨论第131-138页
        5.4.1 cyd操纵子敲除质粒的构建情况第131-132页
        5.4.2 解淀粉芽孢杆菌工程菌的鉴定分析第132-134页
        5.4.3 cyd基因工程菌的鸟苷摇瓶发酵情况第134-136页
        5.4.4 发酵液中有机酸的含量分析第136-137页
        5.4.5 工程菌传代稳定性研究第137-138页
    5.5 本章小结第138-139页
总结和展望第139-142页
    总结第139-140页
    本论文创新之处第140-141页
    展望第141-142页
参考文献第142-157页
附录第157-169页
攻读博士学位期间取得的研究成果第169-170页
致谢第170-171页
附件第171页

 
 
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