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一株高效石油降解菌的筛选及其降解条件优化

【林业生产论文】摘要:从中原油田石油污染土壤中分离到一株新的石油降解菌HNAU-1,经16S rDNA测序鉴定为假单胞菌属(Pseudomonas sp.)。该菌可以以石油为惟一碳源进行生长,10 d的降解率可达50.7%。单因素试验表明添加其他碳源(葡萄糖、淀粉和蔗糖)均可抑制该菌对石油的降解;以尿
 摘要:从中原油田石油污染土壤中分离到一株新的石油降解菌HNAU-1,经16S rDNA测序鉴定为假单胞菌属(Pseudomonas sp.)。该菌可以以石油为惟一碳源进行生长,10 d的降解率可达50.7%。单因素试验表明添加其他碳源(葡萄糖、淀粉和蔗糖)均可抑制该菌对石油的降解;以尿素为氮源,35 ℃(25~35 ℃范围内),pH 7.5,盐度为0.5%,十二烷基硫酸钠为表面活性剂均有利于菌株对石油的降解。
关键词:微生物;降解;石油;优化;筛选
中图分类号:X172 文献标识码:A 文章编号:0439-8114(2016)16-4141-04
DOI:10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2016.16.017
石油是原油和石油制品的总称,是一种由多种烃类(正烷烃、支链烷烃、环烷烃、芳香烃、多环芳烃)及少量非烃化合物和有机金属组成的复杂混合物。据统计,中国每年约有60万t的石油及其制品通过各种途径进入环境,污染土壤、地下水、河流、海洋[1]。石油烃在环境中的持久性很强,危害性也较大,不仅具有强烈的致癌、致畸和致突变毒性[2-5],还能通过食物链在动植物体内逐级富集和放大,进而对人体健康造成严重的威胁[6-8]。石油污染也因此引起人们的高度关注。
对于环境中的石油污染,目前有物理、化学和生物方法将其去除[9]。物理和化学方法虽然见效快,但是成本较高,而且容易造成二次污染,因此限制了其在环境修复中的应用。生物方法最常见的是采用微生物对石油进行降解,该方法成本较低,而且不会造成二次污染,有望成为具有广阔应用前景的修复方法[10]。但是在中国生物方法并未得到广泛的应用,其原因是降解菌活性不高。本研究从中原油田土壤中筛选得到1株高效石油降解菌,并采用单因素试验对其降解石油的条件进行了优化,有望用于未来石油污染修复中。
1 材料与方法
1.1 试验材料
石油污染土壤采自中原油田,用于分离石油降解菌。
液体培养基成分为:(NH4)2SO4 0.5 g、NaNO3 0.5 g、MgS04·7H2O 0.2 g、KH2PO4 1.0 g、NaH2PO4·H2O 1.0 g、CaCl2 H2O 0.02 g,用去离子水配制成1 L液体培养基,调节pH 7.0,121 ℃灭菌20 min。
固体培养基在液体培养基基础上添加18 g/L琼脂粉,121 ℃灭菌20 min即可。
无机盐培养基:葡萄糖5 g、NH4NO3 2 g、K2HPO4 0.5 g、KH2PO4 1 g、MgSO4·7H2O 0.5 g、无水CaCl2 0.02 g、NaCl 5 g、FeCl3·6H2O 0.02 g,用去离子水配制成l L液体培养基,105 ℃灭菌20 min。
1.2 菌株筛选
取1 g石油污染土壤分别添加到100 mL液体培养基中,避光培养(28 ℃,180 r/min)7 d后,转接于新的液体培养基中继续培养,如此反复5次。取0.1 mL培养液均匀涂布在含固体培养基的平板上,30 ℃避光培养,每天观察菌落生长情况。待菌落长出,挑选形态不同的菌落转接到新的含固体培养基的平板上,如此反复数次,直到形成形态单一的菌落,即为纯化的菌株,4 ℃保存,备用[11]。
1.3 菌株鉴定
将纯化后的菌株接种至无机盐培养基培养7 d(28 ℃),观察形态特征,采用DNA提取试剂盒(TIANGEN公司)提取菌株总DNA;采用引物27F及1492R进行石油降解菌的16S rDNA片段的PCR扩增。PCR反应条件为:94 ℃预变性8 min;94 ℃变性1 min,52 ℃退火1 min,72 ℃延伸1 min,34个循环;72 ℃延伸8 min,4 ℃保存。PCR产物由北京美亿美生物技术有限公司进行测序,测序结果导入CenBank数据库中,通过Blast进行同源性比较。
1.4 石油降解率试验
取1 mL菌液(OD600 nm=0.8)接种至100 mL液体培养基中,建立降解体系并进行培养(30 ℃、180 r/min),10 d后分析降解体系中石油含量,以不接菌的处理作为对照。
为研究不同反应条件对菌株降解石油的影响,进行以下5组单因素试验:
1)不同石油浓度:0.5%、1.0%、1.5%、2.0%和2.5%。
2)不同温度:25、30和35 ℃。
3)不同pH:pH 6.5、7.5和8.5。
4)不同盐度:0.5%、1.0%、1.5%、2.0%和2.5%。
5)不同表面活性剂:0.5%曲拉通X-100(TX-100)、0.5%十二烷基硫酸钠(SDS)和0.5%吐温-80。
1.5 石油含量分析
采用重量法分析石油含量[12]。具体方法:在石油降解体系中加入20 mL石油醚,萃取培养基中的石油,重复操作3次;合并上层液,转至分液漏斗,剧烈振荡5 min,静置,待分层后进行分离。用石油醚洗涤三角瓶2~3次,再合并上层液。将其在58 ℃条件下蒸发,待石油醚完全蒸发,残留石油组分置于干燥器中冷却至恒重,称量。计算石油的降解率公式为:
降解率=(m1-m2)/m×100%
式中,m为培养体系中初始石油质量;m1为对照组的残油质量;m2为样品的残油质量。
1.6 数据统计
采用SPSS 13.0软件进行统计分析。
2 结果与分析
2.1 菌株的鉴定
对分离到的石油降解菌HNAU-1进行形态观察,发现菌株边缘整齐,表面湿润,红棕色,半透明,细胞大小为(0.8~1.0) μm×(1.5~2.5) μm,有鞭毛,呈杆状。提取该菌DNA,经PCR扩增、16S rDNA测序,然后通过Blast检索并与GenBank中序列进行比对,发现该菌基因序列与Pseudomonas sp.相似度达97%(图1),表明该菌属于假单胞菌属。 2.2 菌株的生长及对石油的降解特性
以石油为惟一碳源研究菌株HNAU-1的生长曲线和石油降解特性(图2),结果发现OD600 nm在培养期内呈逐步上升趋势,在第10天达到最大值(1.23)。石油的降解率在培养期内也呈逐步上升趋势,在第10天达到最大值(50.7%),较芽孢杆菌属H1对石油的降解率高(35%)[13],由此可见,该菌株能以石油为惟一碳源进行生长,并具有较高的石油降解能力。
2.3 不同碳源对菌株降解石油的影响
通过比较不同碳源对菌株降解石油的影响(图3)发现,不加外源碳源菌株对石油的降解率为48.7%,而在培养基中添加葡萄糖、蔗糖和淀粉时,均不同程度抑制了菌株对石油的降解。其中,葡萄糖的抑制作用最大,降解率仅为9.7%;其次为蔗糖和淀粉,降解率为24.7%和36.5%,这可能与不同碳源的生物可利用性有关,石油属疏水性物质,不易被微生物利用,而3种外源碳源均较石油容易被微生物利用,当这些碳源耗尽时,石油才可被进一步利用,从而被降解。3种外加碳源之中,葡萄糖最容易被利用,因此对石油的降解抑制作用最大。目前碳源对石油降解影响的资料较为少见,该现象提示当采用微生物降解石油时,应避免存在其他容易利用的碳源,否则会降低菌株对石油的降解率。
2.4 不同氮源对菌株降解石油的影响
通过比较不同氮源对菌株降解石油的影响(图4),发现尿素作为氮源时,菌株对石油的降解率最高,达到54.9%,其次为硝酸钾、硝酸铵、硫酸铵和蛋白胨,降解率分别为31.4%、30.7%、24.7%和18.0%。王鑫等[14]曾研究了不同氮源对微生物降解石油能力的影响,发现菌株R4和D3的最优氮源为NaNO3,T4的最优氮源为NH4NO3,可见对于不同菌株,最佳的氮源是不同的。陈梅梅等[15]发现芽孢杆菌的最佳氮源为尿素,与本研究结果相似。
2.5 不同盐度对菌株降解石油的影响
通过比较不同盐度对菌株降解石油的影响(图5),发现随着培养基中盐度的增加,菌株对石油的降解率呈现先增加后降低的趋势,当培养基盐度为0时,菌株对石油的降解率最低,仅为35.5%,当盐度增加到0.5%时,菌株对石油的降解率达到最大值(77.4%),其后随着盐度的增加,菌株对石油的降解率稍有降低,维持在62.5%~67.2%之间。表明适当的盐度有利于菌株对石油的降解,以0.5%为宜。这可能与微生物的长期生存环境有关,该菌株从中原油田附近土壤分离得到,该地区不仅受到石油污染,同时土壤中还有较高的盐分,微生物可能已经适应了高盐的生存环境。多数石油降解菌都具有耐盐能力,例如假单胞菌属DH-5、克雷伯氏菌属DH-9和芽孢杆菌属X-1均在2%的盐度条件下对石油的降解率最高[16,17];在石油污染土壤修复过程中,含盐量也极大地影响着微生物修复效率,土壤中含盐量为0.01%比含盐量0.22%的石油的降解率增加了1.22倍[18]。菌株HNAU-1在0.5%~2.0%的含盐范围内石油降解率均可达60%以上,因此尤其适合高盐石油污染土壤的修复。
2.6 不同温度对菌株降解石油的影响
通过比较不同温度对菌株降解石油的影响(图6),发现随着温度的升高(25~35 ℃),菌株对石油的降解率呈逐渐增加的趋势,其中,以温度达到35 ℃时降解率最高,为55.2%,而温度为25 ℃时石油降解率最低,只有17.0%,表明该菌株最适温度为35 ℃,而当温度过低,降解率会急剧降低,因此该菌株不适合低温环境下对石油的修复。这与辛蕴甜等[12]的研究结果相似。
2.7 不同pH对菌株降解石油的影响
通过比较不同pH对菌株降解石油的影响(图7),发现在一定范围内(pH 6.5~8.5,为北方土壤常见的pH),随着pH的升高,降解率呈现先上升后降低的趋势。当pH 6.5时,降解率只有10.8%,当pH 7.5时,降解率最大,达到50.3%,之后当pH继续升高,降解率开始下降,当pH 8.5时,降解率仅为37.6%。表明该菌株对pH较为敏感,过高或过低的pH均会抑制其对石油的降解,最适pH为7.5。而辛蕴甜等[12]分离到的芽孢杆菌降解石油最适pH为7.0,表明不同菌株最适的pH不同,应与菌株所处的环境有关。
2.8 不同表面活性剂对菌株降解石油的影响
通过比较发现不同表面活性剂对菌株降解石油的影响不同(图8)。不添加表面活性剂菌株对石油的降解率为34.6%,添加TX-100(曲拉通X-100)和SDS(十二烷基硫酸钠)均显著提高了菌株对石油的降解率,分别达到63.6%和67.3%,而添加Tween-80显著抑制了菌株对石油的降解,降解率仅为16.8%。添加表面活性剂是改进菌株对疏水性底物利用的重要措施,张丽芳等[19]研究了4种表面活性剂对微生物降解石油的影响,发现较低浓度的表面活性剂促进石油降解,而当浓度过高时抑制石油降解,可能与表面活性剂本身的毒性有关,本研究发现的Tween-80抑制了石油的降解,可能是由于菌株对Tween-80的耐受性低造成的。
3 小结
从中原油田石油污染土壤中分离到一株石油降解菌HNAU-1,经16S rDNA测序鉴定为假单胞菌属,该菌可以以惟一碳源代谢石油,外加葡萄糖、淀粉和蔗糖均能抑制该菌对石油的降解,采用该菌降解石油,其最佳降解条件为:以尿素为氮源,35 ℃(25~35 ℃范围内),pH 7.5,盐度为0.5%,SDS为表面活性剂,这些结果为进一步采用该菌用于石油土壤修复奠定了基础。
参考文献:
[1] 袁红莉,杨金水,王占生.降解石油微生物菌种的筛选及降解特性[J].中国环境科学,2003,23(2):157-161.
[2] 岳战林,蒋平安.石油类污染物的特性及环境行为[J].石化技术与应用,2006,24(4):307-308.


 
 
 
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