| 摘要 | 第6-7页 |
| Abstract | 第7页 |
| 缩略语 | 第8-10页 |
| 1 文献综述 | 第10-16页 |
| 1.1 链霉菌简介 | 第10-11页 |
| 1.1.1 变铅青链霉菌(S.lividans 1326)简介 | 第10页 |
| 1.1.2 棒状链霉菌(S.clavuligerus NRRL3585)简介 | 第10-11页 |
| 1.2 链霉菌中已知的基因簇和化合物数目的不匹配关系 | 第11页 |
| 1.3 寻找微生物来源的天然产物的策略 | 第11-12页 |
| 1.4 链霉菌中调控系统的研究 | 第12-13页 |
| 1.5 链霉菌接合转移简介 | 第13-14页 |
| 1.6 本课题研究的理论依据,目的和意义 | 第14-16页 |
| 2 材料与方法 | 第16-35页 |
| 2.1 菌株 | 第16-17页 |
| 2.2 质粒与引物 | 第17-18页 |
| 2.3 培养基与生化试剂 | 第18-21页 |
| 2.4 基本实验操作 | 第21-26页 |
| 2.4.1 菌种培养及保藏 | 第21页 |
| 2.4.2 大肠杆菌质粒的抽提 | 第21-22页 |
| 2.4.3 链霉菌总DNA的小量提取 | 第22页 |
| 2.4.4 酶连反应 | 第22-23页 |
| 2.4.5 DNA片段凝胶回收 | 第23页 |
| 2.4.6 PCR及相关技术 | 第23-24页 |
| 2.4.7 大肠杆菌感受态细胞的制备及DNA转化 | 第24-25页 |
| 2.4.8 PCR-targeting中大肠杆菌电转化感受态的制备及电转化 | 第25-26页 |
| 2.4.9 大肠杆菌和链霉菌的两亲本属间接合转移 | 第26页 |
| 2.5 链霉菌cosmid基因组文库构建 | 第26-31页 |
| 2.5.1 质粒载体的制备 | 第26-27页 |
| 2.5.2 棒状链霉菌NRRL3585基因组DNA的制备 | 第27-30页 |
| 2.5.3 回收片段与载体的连接 | 第30页 |
| 2.5.4 连接产物的包装 | 第30页 |
| 2.5.5 包装产物的转染 | 第30-31页 |
| 2.6 高通量接合转移 | 第31-32页 |
| 2.7 生物测定 | 第32页 |
| 2.8 阳性克隆测序 | 第32-33页 |
| 2.9 构建afsR表达载体pHL851 | 第33页 |
| 2.10 棒酸的发酵,检测,HPLC | 第33-34页 |
| 2.11 全霉素的发酵,抽提和检测 | 第34-35页 |
| 3 结果与分析 | 第35-51页 |
| 3.1 S.clavuligerus NRRL 3585 cosmid文库大肠杆菌宿主的构建 | 第35-36页 |
| 3.2 S.clavuligerus NRRL 3585cosmid文库到S.lividans 1326的高通量接合转移 | 第36-37页 |
| 3.2.1 宿主的选择 | 第36页 |
| 3.2.2 接合转移的过程 | 第36-37页 |
| 3.3 生测及表型观察 | 第37-39页 |
| 3.4 蓝色表型的重复验证 | 第39-41页 |
| 3.5 六个阳性cosmid | 第41页 |
| 3.6 afsR_(s.cla)与afsR_(s.c)氨基酸序列比对 | 第41-43页 |
| 3.7 afsR_(cla)表达载体的构建 | 第43页 |
| 3.8 afsR_(cla)单基因对S.lividans 1326抗生素产量的影响 | 第43-46页 |
| 3.9 afsR_(cla)对克拉维酸产量的影响 | 第46-47页 |
| 3.10 S.clavuligerus::pHL851在SC培养基上产生了黄色化合物 | 第47-50页 |
| 3.11 棒状链霉菌中另外一个afsR_(cla)同源蛋白afsR-g | 第50-51页 |
| 4 讨论 | 第51-53页 |
| 4.1 高通量接合转移的方法是非常高效的 | 第51页 |
| 4.2 E.coli XLUZ存在以下优点 | 第51页 |
| 4.3 afsR_(cla)同时提高了棒状链霉菌中克拉维酸和全霉素的产量 | 第51-52页 |
| 4.4 afsR过量表达导致克拉维酸产生延迟 | 第52-53页 |
| 5 主要结论 | 第53-54页 |
| 参考文献 | 第54-58页 |
| 致谢 | 第58-59页 |
| 攻读学位期间发表的学术论文和申请的专利 | 第59页 |
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