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白介素-6拮抗N-甲基-D-天门冬氨酸诱导的神经元凋亡

【制中药论文】作者:刘展 黄慧伟 黄彦 彭聿平【摘要】 目的:在抗凋亡成分Bcl-2、促凋亡成分Bax和凋亡关键酶半胱氨酸蛋白酶-3(cysteinyl asparate-specific proteinase-3,caspase-3)的基因水平,探讨IL-6保护神经元防止N-甲基-D-天门冬氨酸(NMDA)诱导的神经元凋亡。方法:取出生后8 d幼鼠的小脑进行颗粒神经元体外培养。在培养液中加入IL-6(40 ng/ml),孵育 8 d后,用NMDA(100 μmol/L)刺激小脑颗粒神经元30 min,诱导神经元凋亡。用Real-time PCR法检测神经元内Bcl-2、Bax和caspase-3的mRNA表达水平。结果:未用IL-6预处理的神经元,在用NMDA刺激后,其表达Bcl-2 mRNA显著减少,表达Bax mRNA及caspase-3 mRNA明显增加。IL-6本身没有明显影响上述基因的表达。神经元用IL-6预孵育后,再用NMDA刺激,神经元内Bcl-2、Bax和caspase-3的mRNA表达水平与未用IL-6预处理的神经元比较,表现为Bcl-2上调、Bax和caspase-3下调的变化,这些变化均有显著意义。结论:NMDA可诱导神经元的凋亡,IL-6对NMDA诱导的神经元凋亡具有明显的抑制作用。
【关键词】 神经元凋亡;白介素-6;N-甲基-D-天门冬氨酸;Bcl-2;Bax;半胱氨酸蛋白酶-3;大鼠
[Abstract] Objective: We explored that IL-6 protected neurons against NMDA-induced apoptosis at the gene levels of anti-apoptotic Bcl-2, pro-apoptotic Bax and apoptotic enzyme cysteinyl asparate-specific proteinase-3 (caspase-3). Methods: The cerebellar granule neurons from postnatal 8-day infant rats were chronically exposed to IL-6 (40 ng/ml), NMDA (100 μmol/L) was then added to the cultures and stimulated the neurons for 30 min to induce the neuronal apoptosis. Real-time PCR was employed to detect the expression of genes related to neuronal apoptosis, including Bcl-2, Bax and caspase-3. Results: NMDA stimulation of the cultured cerebellar granule neurons without IL-6 pretreatment led to a notable reduction of Bcl-2 mRNA expression, as well as a remarkable enhancement of Bax and caspase-3 mRNA expression. The NMDA stimulation of the neurons that had been pretreated with IL-6 caused a remarkable increase in Bcl-2 mRNA expression, as well as a marked decrease in Bax and caspase-3 mRNA expression in comparison with those of neurons lacking IL-6 pretreatment. Conclusions: NMDA can induce neuronal apoptosis. Chronic IL-6 exposure can protect neurons against NMDA-induced neuronal apoptosis.
[Key words] Neuronal apoptosis; Interleukin-6; N-methyl-D-aspartate; Bcl-2; Bax; Caspase-3; Rat
缺血缺氧等各种因素引起神经系统损伤时,神经末稍释放大量谷氨酸等兴奋性氨基酸,激活N-甲基-D-天门冬氨酸(N-methyl-D-aspartate,NMDA)受体,从而产生严重的神经毒性,引起神经元的损伤或死亡[1]。NMDA是谷氨酸受体亚型的激动剂,已有实验证实,NMDA能通过“兴奋性氨基酸毒性”诱导脑皮质细胞[2]和视网膜神经节细胞凋亡[3-5]。因此,抑制神经元凋亡可成为治疗某些神经系统疾病的关键。
近年来,细胞因子对神经系统的生长、发育和功能的影响已受到了广泛的关注。白介素-6(interleukin-6,IL-6)是一个多功能的细胞因子,在中枢神经系统的生理病理过程中扮演重要角色。在正常脑组织中IL-6的含量较低,但在某些病变的脑内IL-6的含量将会迅速而显著的增加[6-9],说明IL-6与这些神经系统疾病有密切的关系且可能与修复神经元有关。然而,在这些神经系统病理状态下IL-6产生的意义尚不明确,仍有许多问题需要进一步的探讨。为此,我们利用NMDA诱导培养的小脑颗粒神经元(cerebellar granule neurons,CGNs)的细胞凋亡模型,在抗凋亡Bcl-2、促凋亡Bax和凋亡关键酶caspase-3的基因水平,观察IL-6的神经保护作用。
1 材料和方法
1.1 CGNs的培养 取出生 8 d的Sprague-Dawley SD幼鼠2只,雌雄不拘。低温麻醉后取出小脑,用眼科剪把组织剪成1 mm3左右大小,胰酶消化后加入胰酶抑制剂和DNaseⅠ终止消化。最后细胞加入适量含有10%胎牛血清(杭州四季青公司)和25 mmol/L氯化钾的BME(Basal Eagles Medium,美国Sigma公司),以2.83×105个/cm2的细胞密度接种于用多聚-L-赖氨酸(poly-L-lysine,美国sigma公司)25 μg/ml包被的培养板中,然后置于5% CO2的 37℃培养箱(日本ESPEC公司)中培养 8 d。此外,接种后24 h在培养物中加入10 μmol/L Ara-C以抑制胶质细胞的生长,使神经元的纯度达95%以上。
1.2 IL-6慢性预处理CGNs 在CGNs培养的第1、4、7 d,加入IL-6(美国R&D公司)到培养物中,使IL-6的浓度在整个8 d的神经元培养期间始终保持在40 ng/ml。
1.3 NMDA急性损伤CGNs模型 上述培养8 d的CGNs,吸出培养液,用Locke缓冲液洗1遍,加入含NMDA(美国Sigma公司)100 μmol/L的Locke缓冲液,20 ℃作用30 min后吸弃,用 BME洗1遍,再加入原先吸出的培养液置于CO2培养箱中,5% CO2 37 ℃孵育6 h。
1.4 Real-time PCR法检测CGNs内Bcl-2、Bax及caspase-3 的mRNA 表达 取予不同处理的CGNs,提取RNA。逆转录生成第一链cDNA,再进行实时PCR扩增。引物由Invitrogen生物技术公司合成。序列如下:Bcl-2-sense:5’-GCAGAGATGTCCAGTCAG C-3’,Bcl-2-antisense:5’-CCCACCGAACTCAAAGAAGG-3’,预计扩增片段长度为129 bp;Bax-sense: 5’-ATGGGCTGGACACTGGACTTC-3’,Bax-antisense:5’- GAGCGAGGCGGTGAGGAC-3’,预计扩增片段长度为146 bp;caspase-3-sense:5’-GGAACGAACGGACCTGTG-3’,caspase-3- antisense:5’-GCCTCCACTGGTATCTTCTG-3’,预计扩增片段长度为188 bp;β-actin-sense:5’-CGTTGACATCCGTAAAGACC-3’,β-actin-antisense:5’-TAGAGCCACCAA TCCACAC-3’,预计扩增片段长度为176 bp。设定PCR反应程序:95 ℃ 5 min 预变性,94 ℃ 20 s,62 ℃ 20 s,72 ℃ 20 s,循环40次。
1.5 数据处理及统计学分析 Real-time PCR的结果以Ct值表示, 即PCR反应指数增长初期荧光信号跨越阈值时的反应循环数。相对定量采用比较Ct法, 根据等式Fold = 2-△△Ct来计算处理组和对照组之间目的基因的相对表达差异[10],其中△Ct值代表同一样本中目的基因和管家基因的Ct值差异,而△△Ct值表示处理组和对照组间的△Ct值差异,计算结果以两组间目的基因拷贝数的比值,即Fold值来表示。本实验数据都用均数±标准差表示,采用SPSS 11.0统计软件中方差分析进行数据的处理和比较,以P<0.05表示差异具有统计学显著意义。
2 结 果
2.1 IL-6预防NMDA诱导的Bcl-2 mRNA表达抑制 CGNs用IL-6(40 ng/ml)预处理8 d后,用NMDA(100 μmol/L)刺激30 min,然后用Real-time PCR法检测神经元内Bcl-2 mRNA的表达水平。结果显示,未用IL-6预处理的神经元,在用NMDA刺激后,其表达Bcl-2 mRNA显著少于未用任何处理的对照组(图1);单独用IL-6预处理神经元后,未改变其中Bcl-2 mRNA的表达(图1);神经元用IL-6预处理,然后用NMDA刺激,其Bcl-2 mRNA的表达高于未用IL-6预处理的神经元(图1),说明IL-6可预防NMDA诱导的神经元Bcl-2 mRNA表达抑制。
2.2 IL-6拮抗NMDA诱导的Bax mRNA表达增加 与未用任何处理的神经元相比,NMDA显著加强Bax mRNA的表达(图2)。单纯IL-6对神经元的Bax mRNA表达无抑制作用(图2)。神经元用IL-6预处理后再用NMDA刺激,其表达Bax mRNA水平显著低于未用IL-6预处理的NMDA刺激组(图2)。
2.3 IL-6抑制NMDA诱导的神经元内caspase-3 mRNA表达增加 结果如图3所示,与未用任何处理的神经元比较,NMDA显著加强caspase-3 mRNA的表达;IL-6单独处理对神经元的caspase-3 mRNA表达无明显抑制作用;NMDA刺激已用上述IL-6预处理的神经元后,神经元表达的caspase-3 mRNA水平明显低于未用IL-6预处理的神经元,已接近对照水平(图3)。
3 讨 论
正常情况下细胞凋亡是一种生理性调节机制,神经细胞凋亡被认为是维持神经系统生长发育动态平衡的必要手段,但在病理因素干扰下,如兴奋性氨基酸毒性导致细胞内钙水平升高,在众多基因的参与下,细胞凋亡异常,则会导致许多疾病的发生。体内外实验证明谷氨酸的兴奋性毒性主要是通过激活NMDA受体[11],NMDA是特异性NMDA受体激动剂。有文献报道,谷氨酸通过上调Bax及下调Bcl-2蛋白的表达水平从而诱导小鼠海马神经元HT22细胞系发生凋亡[12]。在原代培养的皮层细胞中,谷氨酸经由线粒体信号转导的caspase活化通路上调caspase-3的表达水平诱导细胞凋亡[13]。我们实验室以前的研究表明,NMDA可导致培养的CGNs大量凋亡[14]。本实验中我们用NMDA(100 μmol/L)急性刺激(30 min)培养的CGNs,发现神经元内抗凋亡基因Bcl-2的表达下调,而促凋亡基因Bax及凋亡关键酶caspase-3 mRNA表达均显著增加,从而成功利用NMDA处理CGNs建立了神经元凋亡模型。
IL-6是具有基因多效性的细胞因子,在不同组织不同环境下,其作用也不尽相同。本实验观察到,经IL-6预处理的神经元与对照组相比,NMDA刺激后Bcl-2 mRNA表达明显增加,而Bax及caspase-3的表达则显著减少,上述结果表明IL-6可保护神经元,通过上调Bcl-2表达及下调Bax、caspase-3的表达,从而抵抗NMDA诱导的神经元凋亡。有文献报道,脑缺血时诱导产生的IL-6作为一个潜在的内源性神经保护因子拮抗NMDA受体介导的兴奋毒性作用,且在混合培养或单纯培养的大鼠皮层神经元中,IL-6呈剂量依赖性地保护神经元拮抗NMDA的毒性[15]。此外,rhIL-6能增加缺氧-复氧后海马培养神经元Bcl-2的表达和抑制Bax的表达,减少缺氧-复氧后海马神经元凋亡。我们的研究从抗凋亡、促凋亡和凋亡酶的各个层面,在基因水平进一步说明IL-6具有神经保护作用,因而为IL-6的临床研究和临床应用提供新的思路。
【参考文献】
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