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豆豉中大豆异黄酮及苷元降血糖活性及其机理的研究药学
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【临床西医学检验论文】 作者：郭瑞华 霍文 刘正猛 吴少杰 王和平 王海龙 梁彦云
【摘要】 目的 研究 永川豆豉中大豆异黄酮及苷元的降血糖活性及其降血糖机制。 方法 永川豆豉粉碎，脱脂，然后用65%的乙醇浸泡，超声提取两次。所得提取液离心后旋转蒸发，用无水乙醇提取可得大豆异黄酮的粗提品。正丁醇饱和的水溶液除糖及色素等。然后经硅胶分离出大豆黄素和染料木素。河南鼠注射四氧嘧啶造成高血糖模型，连续7 d灌胃给予所提取的大豆异黄酮及苷元。用葡萄糖氧化酶法测定血糖水平。结果永川豆豉中的大豆异黄酮及苷元能显著地降低四氧嘧啶糖尿病模型鼠血糖水平，缓解糖尿病症状；大豆异黄酮和染料木素都能抑制葡萄糖的活性，尤以染料木素最为明显。结论 豆豉中的大豆异黄酮可以明显地降低小鼠的高血糖，其所含的成分染料木素为主要的降血糖成分之一。
【关键词】 豆豉； 大豆异黄酮及苷元； α葡萄糖苷酶； 染料木素； 降血糖
Abstract：ObjectiveThis article studied the activities and mechanism of Yongchuan fermented soybean isoflavone glycone to reduce the level of blood sugar. MethodsAfter ground and removed of oil, Yongchuan fermented soybean was ultrasonic extracted with 65% alcohol twice. The extraction was centrifuged. The liquid was rotate evaporated and then extracted with alcohol to obtain the crude extract. This crude extraction was removed of sugar and pigment with butanol saturated water and was separated by silica gel chromatography to yield dadezein and genestein. High blood sugar model was constructed by the injection of alloxan into Henan mice. The mice were treated with soya isoflavones for continuous 7 days. The blood sugar level was measured by GOD (glucose oxidase) method. ResultsThe soya isoflavone glycone from Yongchuan fermented soybean can remarkable reduce the level of blood sugar caused by alloxan, relaxing the symptoms of diabetes. Both crude extract of soya isoflavones from Yongchuan fermented soybean and genestein had the ability to inhibit the activity of α-glucosidase, with genestein more potent. ConclusionThe soya isoflavones and isoflavone glycone from Yongchuan fermented soybean can obviously reduce the hyperglycemia of alloxan mice and the main component of reducing blood sugar may due to genestein.
Key words：soybean isoflavone glycone; α-glycosidase; Genestin; Reducing activity on blood sugar 豆豉在我国有着悠久的 历史 ，它在中医药学上是一味中药，也是一种传统的发酵大豆食品，是由豆科植物大豆的成熟种子与青蒿、桑叶等中药发酵而成［1］。豆豉的化学成分复杂,含有丰富的黄酮类化合物［2］，现已知的异黄酮（包括含或不含葡萄糖苷及其衍生物的）同分异构体共有12种［3］。大豆异黄酮具有多种生物学活性,如降血糖、抗骨质疏松、雌激素作用、改善糖耐量等作用［4，5］。糖尿病是一种常见的代谢性的疾病，近年来研究表明植物异黄酮类成分能够 治疗 糖尿病及其并发症。现已有研究表明，大豆异黄酮的降糖作用可能与抑制β细胞凋亡、干扰小肠对糖的吸收使餐后血糖峰值后移与降低、胰岛素样作用促进外周组织利用血糖有关［6～9］。日本已将我国的永川豆豉制成食前粒，其降糖作用明显。但 目前 对其有效成分及其机理并未见详细报道。 本文在已探讨过的豆豉多糖降血糖作用研究的基础上，又研究了大豆异黄酮及苷元对实验性糖尿病的治疗作用及其对α葡萄糖苷酶的抑制作用，进而探讨豆豉中大豆异黄酮降血糖的机理。
1 仪器与试剂 DS-1高速组织捣碎机（上海标本模型厂）, KQ100超声清洗器（昆山市超声仪器有限公司）, RE52AA旋转蒸发器（上海亚荣生化仪器厂）, 722紫外分光光度计（上海精密 科学 仪器有限公司），AE240 电子 天平（METTLER公司）。 市售咸豆豉（四川永川）， 染料木素（纯度98%，sigma公司）， 大豆黄素（纯度95%，sigma公司），α葡萄糖苷酶（EC3.2.1.20，sigma公司），还原型谷胱甘肽（中科院上海生物化学研究所），PNPG(4硝基酚αD吡喃葡萄糖苷，sigma公司) ，四氧嘧啶(Alloxan，Sigma公司)，葡萄糖试剂盒GLU（氧化酶法，液体，北京北化康泰临床试剂有限公司），肝素钠(天津生物化学制药厂)，其它试剂均为国产 分析 纯。
2 方法
2.1 大豆异黄酮及苷元的提取采用醇提法和超声连续提取法［10］除去糖类和色素，得黄白色固体粉末，为异黄酮粗品。
2.2 染料木素和大豆黄素的分离将大豆异黄酮溶解于适量甲醇中，在活化好的硅胶GF254板上点样，以三氯甲烷 ：氯仿（10∶1）展开剂，定距展开。风干后，在ZF1三用紫外分析仪于254 nm下照射，呈深紫红色斑点，且有两个斑点的Rf值与染料木素和大豆黄素标准品的Rf值（0.65，0.62）基本一致。在上述条件下，将大豆异黄酮与硅胶板上点样展开，收集Rf值与染料木素和大豆黄素相同的斑点，分别置于两个不同的烧杯中，捣碎成粉末，用无水乙醇溶解，超声条件下提取30 min，以4 000 r/min的转速离心5 min，离心液旋转蒸发后可分别得染料木素和大豆黄素的晶体，与硅胶板上点样展开，其Rf值与染料木素和大豆黄素基本一致。将染料木素和大豆黄素保存，备用。
2.3 小鼠的降糖活性研究
2.3.1 实验性四氧嘧啶糖尿病动物模型的建立取雄性昆明种小鼠（体重18～22 g），随机分为3组。每组10只，分别为正常对照组（Normal），高血糖模型组(Control)，高血糖模型灌胃组(Alloxan)。高血糖模型组及高血糖模型灌胃组禁食10 h。按200 ml/kg的用量，腹腔注射四氧嘧啶。72 h后人工断尾取血，选取空腹血糖值大于11.0 mol/l的小鼠作为高血糖模型小鼠。
2.3.2 大豆异黄酮及苷元对四氧嘧啶糖尿病小鼠的治疗实验高血糖模型灌胃组按100 mg·kg-1·d-1用量经口服灌胃给药7 d。正常组和高血糖模型组每天注射等剂量的生理盐水。每日观察小鼠皮毛、活动等生长情况。末次给药后，所有动物禁食10 h，按试剂盒方法测定血糖值。处死小鼠取肾做病理切片（HE染色），显微镜下观察，结果如图1，2。
表1 豆豉中大豆异黄酮及苷元对四氧嘧啶小鼠血糖水平的 影响 （略）
由表1的结果可知，注射四氧嘧啶后的小鼠的血糖值明显高于正常对照组。灌胃7 d后，高血糖对照组的值未发生较大的变化。而高血糖灌胃组的血糖值却几乎接近正常值。说明豆豉中的大豆异黄酮及苷元具有一定的降低血糖的作用。 比较图1和图2，发现豆豉中的大豆异黄酮灌胃后肾组织较灌胃前形态明显变好。说明大豆异黄酮具有一定的保护肾组织的功能。
图1 灌胃前小鼠的肾组织切片 （略）
图2 灌胃后小鼠的肾组织切片（略）
2.4 大豆异黄酮及苷元对α葡萄糖苷酶抑制作用的 研究
2.4.1 大豆异黄酮及苷元抑制活性的测定参照沈氏［11］ 方法 进行。
2.4.2 大豆异黄酮及苷元抑制活性的测定分别取100 μl总黄酮，100 μl染料木素，100 μl大豆黄素加入酶活力测定系统中（系统缓冲溶液体积响应减少），而后先与酶保温10 min，再加底物反应10 min，加Na2CO3终止反应，测定在400 nm处的吸收值。不同物质对α葡萄糖苷酶的抑制率见图3（大豆黄素未发现有抑制活性，故未 计算 其抑制率）。
图3 抑制剂对酶的抑制百分率（略）
3 结果与 分析
3.1 大豆异黄酮及苷元对小鼠的降血糖的活性四氧嘧啶诱导的糖尿病模型小鼠空腹血糖水平均高于正常对照组。通过连续的灌胃给药，发现Alloxan2的血糖值与Alloxan1相比明显降低。表明豆豉中所含的大豆异黄酮对高血糖有明显的抑制作用。
3.2 大豆异黄酮及苷元对α葡萄糖苷酶的抑制作用测定结果显示大豆异黄酮对α葡萄糖苷酶具有很强的抑制活性。本试验同时测定了染料木素和大豆黄素对α葡萄糖苷酶的抑制作用，结果显示，染料木素对α葡萄糖苷酶的抑制作用较强，而大豆黄素并未发现有抑制作用。提示大豆异黄酮中，发挥主要降血糖作用的成分是染料木素。 由上结果可见，豆豉中的大豆异黄酮可以明显地降低四氧嘧啶型小鼠的高血糖，其所含的成分染料木素为主要的降血糖成分之一。
4 讨论 大豆异黄酮及苷元的提取工艺有醇提法，酸水解法和超声提取法等。超声提取工艺简捷快速，消耗少，提取率高，我们选用65%的乙醇为溶剂，物液比为1∶10，在室温（25～30℃）下提取6 h，提取效果最佳。豆豉中的化学成分比较复杂，我们进行薄层分离时在染料木素和大豆黄素之外尚发现两个斑点，有报道认为有可能其一为鸡豆黄素A［1］，我们经过实验已证明不是鸡豆黄素A，具体是何物质有待于进一步讨论。 四氧嘧啶是一种β细胞毒剂，可选择性地损伤多种动物的胰岛β细胞，造成胰岛素分泌的下降，引起实验性糖尿病［9］。本实验对病理切片观察发现，四氧嘧啶糖尿病模型组的肾小球：固缩，体积减小，结构不清；肾小管：远曲管，近曲管结构尚清晰，近曲小管肿胀，胞浆浅染，少见粉染颗粒；间质，炎细胞浸润。灌胃后的肾小球：结构清晰、饱满，毛细血管球结构较好；接近正常肾小球；间质仍有少量炎细胞浸润。见图1～2。由于技术的原因，对肝组织的病理切片效果不佳，未发现对其造成明显的损害。是否会造成肝组织损伤有待于进一步讨论。
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