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中药骨康灵联合同位素药物锝99亚甲基二膦酸钠治疗兔骨质疏松的实验研究
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【西药学科研论文】作者：赵国定, 高克加, 田英敏, 叶智卫, 李伟, 宋海萍, 蔡征宇【摘要】 目的：探讨自制煎方骨康灵联合非放射性同位素药物锝99亚甲基二膦酸钠（technetium ［99Tc］ methylene diphosphonate injection, 99TcMDP）治疗骨质疏松症的优越性。方法：肌肉注射盐酸地塞米松针剂（dexamethasone, DX）制作兔骨质疏松模型，将实验兔分为8组：A、B组为正常对照组；C、D组为骨质疏松对照组；E组为99TcMDP治疗组；F组为氨基二膦酸盐治疗组；G组为单用骨康灵治疗组；H组为99TcMDP联合骨康灵治疗组。A、C组实验兔于实验第8周处死，以证实骨质疏松模型成立。E、F、G、H组实验兔于治疗16周后与B、D组一起处死，行病理细胞学分析、骨形态计量分析、骨密度检测、生物力学试验、X线摄片、CT摄片、核素骨骼扫描以及血清骨碱性磷酸酶（bone alkaline phosphatase, BALP）和骨钙素（骨谷氨酸蛋白）（bone gla protein, BGP）的测定。结果：实验兔连续肌肉注射DX 8周后，A组实验兔骨小梁排列规则，呈正常骨组织形态。C组实验兔骨小梁排列稀疏，存在较明显的骨小梁断裂现象，呈骨组织破坏形态，同时A、C两组在骨密度、骨生物力学、骨形态计量等方面的差异，均有统计学意义。实验室检查结果显示，兔骨质疏松动物模型成立。实验第9周对E组、F组、G组、H组实验兔进行治疗。细胞病理切片显示，D组实验兔骨小梁明显稀疏，有断裂和缺损区或凹陷。B组骨小梁排列均匀、规则，H、E组的细胞学表现为在骨质疏松的基础上骨质和骨小梁明显得到了修复，骨小梁增粗，F组实验兔的细胞学表现则优于G组，G组又略优于D组，H、E组更明显优于D组。结论：骨康灵与具有高亲骨特异性调节骨代谢作用的同位素药物99TcMDP联合治疗兔实验性骨质疏松的效果明显优于单独治疗。
【关键词】 骨质疏松; 99m锝美罗酸盐; 治疗; 兔
Objective: To evaluate the advantage of Gukangling Decoction (GKLD), a compound traditional Chinese herbal medicine, combined with technetium ［99Tc］ methylene diphosphonate injection (99TcMDP) in treating osteoporosis in rabbits.
Methods: A rabbit model of osteoporosis was established by intramuscular injection of dexamethasone (DX). Fiftysix rabbits were divided into 8 groups: Group A, B, C, D, E, F, G and H. Rabbits in groups A and B were intramuscularly injected normal saline as normal control, groups C and D were untreated groups, rabbits in group E were treated by 99TcMDP, rabbits in group F were treated by aminodiphosphate, rabbits in group G were treated by GKLD, and rabbits in group H were treated by 99TcMDP and GKLD. Rabbits in groups A and C were executed to demonstrate the establishment of the rabbit model of osteoporosis at the 8th week of experiment. Rabbits in the other six groups were executed after 16week experiment (8week treatment), and then bone structure and cell shape were observed by electron microscope, Xray, CT and emission computed tomography (ECT). Bone density, biomechanical parameters, the levels of bone specific alkaline phosphatase (BALP) and bone Gla protein (BGP) were measured too.
Results: After 8week of intramuscular injection of DX, the bone trabecula in group A were regular and showed normal configuration, while the bone trabecula in group C were sparse, ruptured and showed damaged form. The bone density and biomechanical parameters in group A were higher than those in group C, indicating that the rabbit model of osteoporosis was established successfully. At the 9th week of experiment, the results of cell pathology in group D showed that the bone trabeculas were sparse, ruptured, defected or had hollow section, but the bone trabeculas in group B were regular and dense. The bone trabeculas in groups H and E were restored, and were thicker than those in group D. The bone quality in groups H and E was better than group D significantly, the bone quality in group F was better than group G, and the bone quality in group G was better than group D slightly.
Conclusion: GKLD combined with 99TcMDP had superiority in treating osteoporosis of rabbits as compared with the respective single therapy.
Keywords: osteoporosis; technetium Tc 99m medronate; therapy; rabbits
骨质疏松症是中、老年人较普遍存在的疾病［1，2］，在老龄化的城市里尤为突出。我科采用锝99亚甲基二膦酸钠（technetium ［99Tc］ methylene diphosphonate injection, 99TcMDP）联合我院自配中药处方骨康灵治疗骨质疏松动物模型，并与各药物（氨基二膦酸盐、99TcMDP和骨康灵）单独治疗进行了疗效比较。
1 材料与方法
1.1 实验动物 制作骨质疏松动物模型的实验兔由上海生旺实验动物养殖有限公司提供；动物实验场所为上海交通大学第六人民医院动物实验室。
1.2 药物及试剂 同位素药物99TcMDP由成都云克药业责任有限公司提供，其中，A瓶为99Tc液，5 ml/瓶，1.1 μg/ml，B瓶为MDP，5 mg/瓶；盐酸地塞米松针剂（dexamethasone, DX）1 ml/支，5 mg/ml，由上海信谊药厂生产；氨基二膦酸盐（阿仑膦酸钠）由默沙东（意大利）公司美国默克公司分部提供，10 mg/片；上海市黄埔区中心医院中医内科经长期研究自制煎方骨康灵，由黄芪、熟地黄、骨碎补、仙灵脾、鹿角片、炙龟板、红花、参三七、全蝎等药组成。
1.3 实验室检测 骨密度、骨形态计量分析和生物力学试验由复旦大学医学院骨代谢实验室协助检测；骨细胞学分析、X线、CT摄片、核素骨骼扫描、兔血清骨碱性磷酸酶（bone alkaline phosphatase, BALP）以及骨钙素（骨谷氨酸蛋白）（bone Gla protein, BGP）采用国产生化仪、放射免疫γ检测仪和国产试剂检测，在上海市黄浦区中心医院进行。
1.4 动物分组及处理 健康新西兰实验兔56只，平均体质量（3.00±0.16）kg。将实验兔分为8组：A、B组为正常对照组；C、D组为骨质疏松对照组；E组为99TcMDP治疗组；F组为氨基二膦酸盐治疗组；G组为骨康灵治疗组；H组为骨康灵联合同位素99TcMDP治疗组，每组各7只。所有药物治疗组均在骨质疏松模型基础上进行治疗。A、C组实验兔在实验第8周处死，以证实骨质疏松模型成立。E、F、G、H组于治疗16周后与B、D组一起处死。
1.5 动物模型制作方法 健康新西兰实验兔购入后，先适应性饲养2周，然后C、D、E、F组肌肉注射DX 2 mg/kg，每周2次，为保证实验的相对一致，A、B组肌肉注射2 ml生理盐水。8周后，D、E、F、G、H组继续维持DX肌肉注射，但剂量改为每周2 mg/kg。
1.6 治疗方法及剂量 具体的治疗方法及剂量按照目前成人治疗标准确定。99TcMDP治疗方法：将A瓶中99Tc液5 ml注入B瓶内，摇匀1 min后，用生理盐水稀释，以0.2 mg/kg（5 ml）对E组实验兔进行耳静脉推注治疗，每周1次。氨基二膦酸盐用水稀释成每3 ml含0.2 mg，采用软管喂服法，清晨给实验兔服用，0.2 mg/kg，1次/d。骨康灵，以成人常规用量（每次150 ml，2次/d）按公斤体质量比例给实验兔用药，采用软管喂服法，每次10 ml，2次/d。以上治疗时间均为16周。
1.7 检测项目 取第3腰椎（L3）和右侧股骨头进行病理细胞学分析以及骨形态计量分析。第4腰椎（L4）和左侧股骨头行骨密度和生物力学试验。行X线摄片、CT摄片、核素骨骼扫描［取感兴趣区（region of interest, ROI）膝关节与股骨中段的比较］，检测治疗后血清BGP、BALP指标（血清BALP检测经56 ℃水浴处理20 min后进行检测）。实验兔DX注射8周时，测定A、C组实验兔腰椎和股骨头细胞学状况、骨形态计量、骨密度、生物力学参数，行X线摄片、CT摄片和核素骨骼扫描，检测血清BGP和BALP含量，分析A、C组以上指标的差异是否有统计学意义，以证实骨质疏松模型的建立与否。16周后，B、D、E、F、G和H组均测定上述与A、C组相同的实验室检测项目，分析B、D、E、F、G、H组之间的各项指标的差异是否具有统计学意义。
1.8 检测步骤 实验兔经适应性饲养后，C、D、E、F组均肌肉注射DX 2 mg/kg，每周2次，共治疗8周，A、C组进行X线、CT摄片和核素骨骼扫描后处死，取腰椎和股骨头进行病理切片细胞学分析、骨形态计量分析（骨小梁体积）、骨密度检测和生物力学试验，并取BALP、BGP测定用血清。16周后，B、D、E、F、G、H组进行上述与A、C组同样的检测过程后，处死实验兔。
1.9 统计学方法 实验数据用x±s表示，采用t检验。
2 结果
参考有关制作兔骨质疏松动物模型的资料［3］，C、D、E、F、G、H组实验兔肌肉注射DX 2 mg/kg，每周2次，连续8周，然后对A、C组进行X线、CT摄片、核素同位素发射计算机辅助断层显像（emission computed tomography, ECT）骨骼显像，处死后取血清测定BALP、BGP含量，同时取L3、右侧股骨头行病理切片分析，取L4、左侧股骨头和实验兔的后肢膝关节行骨密度检测和生物力学试验，另对病理切片进行形态计量分析测定。检测结果显示A、C组以上各项指标的差异均有统计学意义（P＜0.01）。见表1。
表1 A、C组实验室检测结果（略）
Table 1 Experimental parameters of groups A and C
**P＜0.01, vs group A.
病理细胞学显示A组实验兔骨小梁排列规则，呈正常骨组织形态。C组实验兔骨小梁排列稀疏，存在较明显的骨小梁断裂现象，骨母细胞不易在视野中发现，稀疏和断裂的骨小梁间存在脂肪组织填充，呈骨组织破坏形态。X线和CT摄片示B组的骨小梁较A组略显稀疏，但不明显。核素ECT骨骼显像显示C组实验兔与A组相比较，C组各大关节的放射性摄取有所增强，而且骨骼显像较模糊，以椎体更明显。处死前C组实验兔活动的灵敏度明显低于A组。C组与A组的实验室指标比较：左股骨头、L4骨密度分别降低23.85%和28.39%；左股骨头、L4骨生物力学分别降低52.19%和104.08%；骨形态计量降低80.98%；核素骨骼显像和BALP、BGP分别升高9.21%和250%、41.64%；以上实验室检测结果显示，采用激素DX注射实验兔，兔骨质疏松动物模型成立。
第9周开始分别对E、F、G、H组进行99TcMDP、氨基二膦酸盐、骨康灵治疗和骨康灵联合99TcMDP治疗。连续治疗16周后行X线摄片、CT摄片、核素骨骼显像。X线摄片可见D组实验兔的骨组织呈骨质疏松样改变，股骨头的骨质隐见斑块状、不均匀现象，基本与C组相似；B组骨组织为正常排列状态，骨小梁排列整齐，也基本与A组相同。核素骨骼显像见D组的骨组织放射性分布为增强和模糊现象，以椎体最为明显，各大关节处放射性分布也增强。H组、E组骨骼显像情况与B组的放射性分布基本相似，而F组的放射性分布还略优于G组。CT摄片显示H组、E组骨组织显像情况也基本与B组相同，但H组、E组的股骨头显示为骨组织透亮性增强、增白现象，F组则表现为股骨头的透亮度有所增强，而D组股骨头则为骨小梁稀疏、骨皮质明显变薄和骨质疏松现象等表现，G组的骨形态学稍好于D组实验兔。在饲养过程中，B组有一只实验兔于第13周时死亡；D组2只分别在第11、14周死亡；G组1只于第14周死亡。死亡的实验兔均为在购入时就比较瘦小，终因腹泻而死亡。其他实验兔的一般情况较正常。各组实验兔的实验室检测结果见表2。
细胞学分析，B组与D组之间也存在较明显的差异，病理切片显示D组的骨小梁明显稀疏，有断裂和缺损区或凹陷，骨母细胞排列不清。B组骨小梁排列均匀、规则，与A组结构基本相似。H、E组的细胞学表现为骨质和骨小梁明显得到了修复，骨小梁增粗。见图1。F组的细胞学表现则优于G组，而G组略优于D组，H、E组明显优于D组。
表2 治疗16周实验室检测结果（略）
Table 2 Experimental parameters after 16week treatment
**P＜0.01, vs group D; △P＜0.05, vs group F; ▲P＜0.05, vs group G.
图1 各组骨组织细胞学特征（略）
Figure 1 Cytology characteristics of bone tissue in different groups
A: Group B; B: Group D; C: Group E; D: Group F; E: Group G; F: Group H.
3 讨论
骨质疏松症是一种常见的疾病，会严重影响患者生活质量，尤其是需长期采用糖皮质激素维持治疗的患者，该病的发病率更高。虽然临床上治疗骨质疏松症的药物较多［4］，但其疗效不一。中西医结合疗法是一种非常有价值的临床治疗骨质疏松症的方法［57］，可使中医和西医的疗效互补。本实验采用糖皮质激素DX诱导制作兔骨质疏松动物模型［3］，运用99TcMDP、氨基二膦酸盐、骨康灵单独治疗和骨康灵联合99TcMDP连续治疗16周后，比较实验室检查各项指标，结果表明H、E组明显优于D组(P<0.01)，H治疗组骨密度、骨力学、骨形态计量、骨ALP和BGP检测值优于F、G治疗组(P<0.05)，但与E组比较，均值虽存在差异，但无统计学意义。结合病理切片，说明骨康灵联合99TcMDP治疗骨质疏松动物模型具有改善骨组织形态学的价值。
双膦酸盐类可在短时间内快速且强有力地吸附在骨组织的羟基磷灰石表面，在骨质代谢中能够明显抑制破骨细胞的活性。99TcMDP是一种经过衰变的放射性同位素99Tc标记在MDP结构上的化合物。99TcMDP与骨骼显像剂99TcmMDP的化学结构相同，物理性质不同（后者99Tcm具有放射性示踪作用，而前者99Tc没有m，则没有示踪作用），因此存在骨质疏松者在骨骼扫描时就能显示99TcmMDP在骨组织中的分布和骨损伤的情况。99TcMDP进入人体1～2 h内约有75%与骨组织的蛋白质结合，沉积在羟基磷灰石表面，有很好的亲骨性［1］。有资料报道，99Tc在人体内具有调节机体免疫功能的作用，能清除人体内自由基，保护过氧化物歧化酶的活力，因此也有医院采用99TcMDP治疗免疫系统的疾病［8］，如甲状腺机能亢进性凸眼、类风湿性关节炎、强直性脊椎炎以及银屑病性关节病等，取得了较好疗效。MDP是一种双膦酸盐化合物，与抑制破骨细胞的功能和抑制骨钙的流失有关，MDP的这项功能已被学术界所公认。99TcMDP与单纯的膦酸盐药物治疗骨质疏松动物模型的研究结果提示99TcMDP治疗骨质疏松症的疗效优于单纯的双膦酸盐化合物［3］，所以99TcMDP不仅具有双膦酸盐的作用，在骨组织的代谢中可能还存在某种复合型功效。
祖国医学认为筋骨与肝肾二脏关系密切。骨康灵由中药炙黄芪、骨碎补、鹿角片、红花等药为主要成分组成，从益气活血、补肝肾、壮筋骨入手，对骨组织的生长和代谢能起到促进作用，动物实验显示该方治疗骨质疏松有一定的疗效。现代中药药理研究发现补肾中药可以有效地防止卵巢切除大鼠的骨矿物质丢失和股骨抗弯强度的下降，但不能使已经丢失的矿物质含量和降低的抗弯强度恢复，其部分机制是通过补肾中药微弱的性激素样作用降低骨转化而抑制骨吸收，但性激素样作用可能不是主要作用［9］。此外，有研究表明女性肾虚患者血中雌二醇与睾酮比例下降，而给予补肾中药治疗后，患者雌二醇与睾酮比值升高，甚至恢复到正常水平。这可能是其改善患者肾虚症状的机制之一［10］。
本实验的结果显示H治疗组患者的骨代谢指标优于F治疗组和G治疗组(P<0.05)，在部分检测指标均值方面也略优于E组，但差异无统计学意义。
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