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纳米脱钙骨基质的制备及其性能检测
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【中药学本科毕业论文】作者：黄凯，陈雄生，贾连顺，邵将，朱巍，严望军，房雷【摘要】 [目的]通过MICROS超细粉碎机制备同种异体纳米脱钙骨基质(DBM)，观察纳米DBM结构特征，研究DBM纳米化工艺及其作为骨移植替代物的生物相容性。[方法]采用改良Urist法制备同种异体脱钙骨基质，液氮冷冻球磨机将块状DBM预粉碎，使用MICROS超细粉碎机进一步研磨粉碎制备纳米DBM。电镜扫描观察其结构，按照我国卫生部《生物材料和医疗器材生物学评价的技术要求》中的标准，对纳米DBM进行急性毒性实验、热原实验、溶血实验等检测。[结果]制备颗粒直径在50～200纳米的脱钙骨基质，生物相容性检测无毒性，无热源性，不引起溶血反应，纳米DBM具有良好的生物相容性。[结论]纳米DBM可在低温或控制温度条件下制备，是一种无毒、无刺激，不含热源、不引起免疫排斥反应的生物材料，具有良好生物相容性。
【关键词】 纳米脱钙骨基质; MICROS超细粉碎机; 显微特征; 生物相容性
Abstract: [Objective]To observe the structure characteristics of nano decalcified bone matrix (DBM) produced by MICROS super fine mill, and to study the nano-technologies of DBM and the biocompatibility of nano-DBM as bone graft substitutes. [Methods]Improved Urist method was used to produce DBM. The pieces of DBM was pre-porphyrizated by liquid nitrogen frozen ball mill equipment. The DBM powder were further porphyrizated by MICROS super fine mill to be nano-DBM. The structure of nano-DBM was observed by electron microscope.The experiments on acute toxicity, pyrogen and hemolysis were performed according to theTechnical Evaluation Standards of Biomedical Materials and Medical Instruments promulgated by Chinese Ministry of Health.[Results]The DBM was porphyrizated to the size of 50-200 nm in diameter. No toxicity, pyrogen nor hemolysis of nano-DBM was noted. Nano-DBM exhibited excellent biocompatibility.[Conclusion]Nano-DBM produced under the conditions of low or controlled temperature, is a kind of biomaterial which is avirulent, nonirritant, nonpyrogenic, nonimmunological reaction and reveals good biocompatibility.
Key words：nano-DBM; MICROS; micro-characteristic;biocompatibility
随着对疾病认识程度的加深及外科技术的发展，临床上对骨移植的需求量越来越大[1]。据统计，在美国每年约施行42万余例植骨融合术，其中60%以上为脊柱融合术。用于脊柱融合术的骨移植替代物和促进骨融合相关产品的医疗市场达4～20亿美元[2]。按此估算，我国每年实施的脊柱融合术数量不亚于这一数字，其未来的骨移植材料市场需求极大。
目前国内外骨移植的材料主要包括自体骨、异体骨和合成骨替代材料3大类。自体松质骨，特别是自体髂骨被认为是骨移植材料的金标准，但其也存在供骨量及供骨尺寸和大小有限、手术时间延长、患者创伤增加、供骨区并发症等缺点[3]。同种异体脱钙骨基质是经过特殊处理制成的一类异体骨，是由胶原蛋白、非胶原蛋白以及较低浓度的生长因子等组成的复合物，是异体骨移植替代材料中免疫源性最弱的一种。不同条件制备的脱钙骨基质存在骨诱导和骨传导性能的差异，另外由于脱钙骨基质失去了绝大部分的无机成分，其生物力学特点几乎完全消失，不适用于需要承受重力和其他任何应力的部位。
研究、制备理想的骨移植材料替代自体骨用于骨缺损修复是目前医学和生物材料科学的重要课题。随着纳米科技及纳米医学的飞速发展[4]，纳米骨移植材料的相关研究发展态势迅猛[5]。本文使用MICROS超细粉碎机在室温环境下将人同种异体脱钙骨基质粉碎至纳米颗粒，并就纳米脱钙骨基质的制备工艺、生物相溶性进行探索，为纳米脱钙骨基质(Nano-DBM)作为一种新的骨移植替代物及骨生长因子载体进一步在临床推广应用提供理论基础。
1 材料和方法
1.1 MICROS超细粉碎机[6]制备纳米DBM
MICROS超微粉碎机是由日本研制的粉碎设备，研磨部件由定子和转子组成。定子即圆形容器，转子由主轴与多根副轴相连，每个副轴上都有多个研磨环，每个研磨环均可独立转动，各个研磨环之间有微小间隙。
将研磨原料和研磨介质放入容器内，主轴带动副轴以相同的角速度旋转，副轴上的研磨环有公转和自转。副轴旋转产生的离心力使研磨环产生径向位移，与筒壁接触，夹在研磨环与筒壁间的材料以及夹在2个研磨环之间的材料同时受到挤压、剪切力的作用而被粉碎。通过调整变压器可控制主轴的转速;容器内温度被实时监测，防止研磨时间长导致材料升温。
采用手术时切除下来的人体骨，采用改良Urist法[6]制备脱钙骨基质。将制得的DBM颗粒与钢质研磨球一同放入液氮冷冻球磨粉碎机的容器内，持续注入液氮条件下以800 RPM研磨2 h。研磨完成后使用网筛将DBM粉末与研磨球分离。
将液氮冷冻粉碎所得DBM粉末置于MICROS粉碎机的容器内，加入适当的蒸馏水，以1 200 r/min的最佳工作转速进行分时间断研磨，期间取样送激光粒度仪进行检测，研磨完成后取样送电镜扫描。
MICROS粉碎机初始研磨温度为17℃，工作中最高温度为25℃，研磨时由循环水进行冷却降温。粉碎过程中由激光粒度仪测量纳米DBM溶液，观察溶液内颗粒直径变化趋势。
研磨结束后将匀浆进行高速离心取得纳米DBM，将之塑形后置于37℃恒温干燥箱内干燥，最终制得纳米DBM。样品经电镜扫描观测颗粒直径及表面结构。
1.2 生物相容性检测
1.2.1 急性毒性实验[7] 将钴60辐照消毒的纳米DBM放入无菌生理盐水中，37℃恒温水浴箱中持续浸泡120 h制备材料浸提液。
取健康成年小鼠10只，雌雄不限，体重25～30 g，随机分为实验组和对照组，实验组腹腔内注射浸提液(50 ml/ kg体重)，对照组腹腔内注射生理盐水(50 ml/ kg)。实验前后均用市售饲料饲养，观察注射后24、48、72 h小鼠的精神状态、进食量等指标。
1.2.2 热原实验[7] 以上述方法制备DBM浸提液。取新西兰家兔3只，雌雄不限，体重2. 3～2.7 kg，电子体温计预测家兔肛温，1次/ h，共4次，体温在38. 6℃～39.1℃，且最大温差≤0. 4℃，参照中国卫生部《生物材料和医疗器材生物学评价技术要求》，符合实验要求。
7 d后在同样室温和湿度下，再次测家兔肛温2次，间隔1 h，取平均值为正常体温;自家兔耳沿静脉推注温度为37℃的DBM浸提液(10 ml/ kg体重)，注射后每小时测肛温1次，共3次，以3次中最高的一次减去正常体温，即为该家兔的体温升高度数。
1.2.3 溶血实验[7] 抽取新西兰家兔静脉血5 ml，加入2 %草酸钾0.25 ml，取该兔血4 ml加入0.9 %生理盐水5 ml进行稀释，制备出新鲜稀释兔血。
实验组：取纳米DBM 1份约5 g，浸泡于含有10 ml生理盐水的试管内,37℃水温中维持30 min，然后加入0.2 ml稀释兔血，缓慢混合，在37℃水温中维持60 min;
阴性对照组：在10 ml生理盐水中加入0.2 ml稀释兔血;
阳性对照组：在10 ml蒸馏水中加入0.2 ml稀释兔血，轻轻振动，使之完全溶血。
阴性和阳性对照均为3只试管,保温条件与实验组相同。以2 000 r/min×5 min将所有试管离心，取上清，用分光光度计于波长545 nm测吸光度，每组取3只试管平均值。
溶血程度按以下公式计算：溶血程度= (实验组吸光度-阴性对照组吸光度)/(阳性对照组吸光度-阴性对照组吸光度)×100%。
2 结果
2.1 纳米DBM的检测结果 MICROS粉碎过程中，激光粒度仪测定溶液样本显示：随着研磨时间的延长，溶液内颗粒直径有逐渐变小的趋势，当颗粒直径达到1微米左右时趋于稳定，延长研磨时间颗粒直径不再变小(图1)。
将制备的纳米DBM进行电镜扫描：放大至20 000倍，可见DBM颗粒直径在50～200 nm左右，分布较均匀，DBM表面具有不规则的纳米沟槽[7]。
2.2 生物相容性实验结果
2.2.1 急性毒性实验结果 实验组小鼠，均无死亡，无瘫痪及呼吸抑制等反应，进食、活动、反应等一般情况良好，体重无明显变化，与对照组相比无明显差异。纳米DBM属于无毒级。
2.2.2 热原实验 各实验家兔体温升高在0.15℃～0.35℃，符合热原检测规定(表2)，纳米DBM无致热作用。
2.2.3 溶血实验 根据公式计算，体外新鲜兔血溶血率为3.31%，在允许范围内(3%～5%)。
3 讨论
3.1 DBM纳米化工艺的选择
纳米材料的制备方法很多，不同材料选择的制备方法也不同。总体可分为物理方法和化学方法。这些方法在制备纳米颗粒时多数需要对材料进行加热，甚至是高温高压处理，适用于金属、陶瓷等无机物的纳米化。DBM等有机材料在高温高压下将完全被破坏，即使是加热或者使用化学试剂的处理都会影响到DBM所携带的各种蛋白因子的活性。因此DBM的纳米化比较理想的方法是选择低温、物理研磨的方法。 图1DBM粉碎溶液样本激光粒度仪检测结果
目前，国内外对有机材料的纳米化研究并不多，适用于有机材料纳米化的方法、设备也较少[8]。作者选择的液氮冷冻球磨粉碎及MICROS超细研磨粉碎均属于低温物理研磨的方法，可以把对DBM的生物活性的影响降低到最小限度。
影响DBM纳米化的因素：
MICROS适用于各种无机物、有机物的粉碎，DBM也在其适用范围内。影响MICROS粉碎后DBM颗粒粒径大小的因素有DBM初始粒径大小、MICROS主轴转速、粉碎时间和材料浓度等。
由于MICROS研磨部件之间的间隙很小，材料的初始粒径如果远远超过研磨间隙，则无法进入研磨间隙而得到有效研磨，因此DBM初始粒径在微米级比较适宜。我们使用液氮冷冻球磨将DBM预粉碎至微米级，再由MICROS进一步粉碎。
MICROS主轴转速越高，产生的离心力和剪切力越大，在相同时间里颗粒被粉碎得越小;当主轴转速不变时，延长粉碎时间，颗粒的粒径将逐渐变小。DBM浓度越大，颗粒之间的距离越小，剪切力可以更多的集中在颗粒上，从而在短时间内得到较小粒径的颗粒;但是浓度过高将导致粘度过高、颗粒严重团聚，反而不利于纳米化;浓度过低则降低了粉碎机的效率，加大了粉碎机的损耗。
纳米DBM的生物相容性：
理想的骨移植替代材料应具有良好的生物相容性，即无毒性、无热原性、不引起溶血反应，对周围组织无刺激性，能被机体组织取代或被降解吸收。DBM经过国内外学者多年的研究，证实其具有良好的生物相容性。纳米化的DBM颗粒仅改变了DBM的立体结构，因此也具有良好的生物相容性。本实验通过急性毒性实验、热原实验、溶血试验等证实了DBM与纳米DBM均是一种无毒、无刺激，不含热源、无免疫原性的生物材料。
4 结论
纳米DBM有良好的生物相容性，是一种无毒、无刺激，不含热源、无免疫原性的生物材料;纳米脱钙骨基质可稳定的存在于溶液中，加上其表面的较高活性可使其能和其他复合物均匀、有效结合;纳米DBM可按需要随意塑形，塑形干燥后所得任意形状的纳米DBM具有很好的韧性和一定的延展性，在一定程度上满足临床植骨的力学要求。
【参考文献】
[1] Greenwald AS, Boden SD, Goldberg VM,et al.Bone-graft substitutes:facts, fictions, and applications[J].J Bone Joint Surg Am，2001，83:98-103.
[2] Khan SN, Sama A, Sandhu HS. Bone graft substitutes in spine surgery[J].Current Opinion in Orthop，2001，12:216-222.
[3] Tadashi K, Ryun-Min K, Masakazu K.Novel bioactive materials with different mechanical properties[J].Biomaterials,2003，24:2161-2175.
[4] 赵晓明.纳米材料的特性及应用[ J ].电大理工，2005，4:35-36.
[5] 钱鋆，沈尊理.运用组织工程原理结合纳米技术构建骨组织的实验研究[J].中国修复重建外科杂志，2006，5：561-564.
[6] Reddi AH, Huggins C. Biochemical sequences in the transformation of normal fibroblasts in adolescent rats [J].Proc Natl Acad Sci USA，1972，69:1601-1605.
[7] 钱鋆，张兆锋.冻干脱钙骨表面纳米结构对细胞行为的影响[J].中国矫形外科杂志，2005，12:911-914.
[8] 马培艳，傅正义.纳米六味地黄液的制备与性能[J].材料研究学报，2005，4:413-418.
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