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初探山慈姑及其伪品对酪氨酸酶活性的影响
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【免费药学论文】作者：黄小容, 王慧娟，贺定祥，周英【摘要】 目的初探山慈姑及其伪品对酪氨酸酶活性的影响。方法采用多巴色素法，底物为L-多巴，测定山慈姑及其伪品提取物对酪氨酸酶的激活作用；薄层色谱法对药材中的酪氨酸进行定性鉴别。结果山慈姑的激活作用最高，丽江山慈姑和金果榄作用不明显，白及呈抑制作用；薄层检测显示山慈姑、丽江山慈姑和金果榄中含有酪氨酸。结论 初步认为酪氨酸为山慈姑等激活酪氨酸酶活性作用的主要成分之一。
【关键词】 山慈姑; 伪品; 酪氨酸酶; 酪氨酸; 激活作用
Abstract：Objective The effects of Cremastra appendiculata (D.Don) Makino and spurious breed on the activity of tyrosinase were studied. MethodsTyrosinase activity was determined by the dopachrome method using L-DOPA as the substrate and the amount of dopachrome in the reactiom mixture was measured by spectrophotometer. Tyrosine was identified by TLC. ResultsThe results showed that the Cremastra appendiculata (D.Don) Makino significantly increased the activity of tyrosinase,but the Rhizoma Bletillae inhibited . The Cremastra appendiculata (D.Don) Makino, Iphigenia indica Kunth et Benth and Tinospora capilipes Gagnep had tyrosine. ConclusionTyrosine is one of the major components of the Cremastra appendiculata (D.Don) Makino, Iphigenia indica Kunth et Benth and Tinospora capilipes Gagnep to stimulate the activity of tyrosinase.
Key words：Cremastra appendiculata Makino; Spurious breed; Tyrosinase; Tyrosine; Effect
酪氨酸酶又称多酚氧化酶,是哺乳动物体内黑素代谢的关键酶。对酪氨酸酶活性调节可直接影响黑色素的合成，其中酪氨酸、多巴、铜等可影响酪氨酸酶的活性［1］，其活性改变可引起色素障碍性皮肤病如白癜风。因此，能够激活酪氨酸酶活性并加速黑色素生成的药物，均可提高因缺乏黑色素所致疾病的疗效［2］。
根据闫军等［3］报道，山慈姑具有激活酪氨酸酶活性的作用。作者对山慈姑进行化学成分研究中，分离得到了影响酪氨酸酶活性的物质——酪氨酸。同时，由于市场上山慈姑的品种比较混乱，很多地方常以白及、金果榄、丽江山慈姑等的球茎或块根代替正品使用［4］。本实验选用山慈姑及伪品进行研究，采用多巴色素法和薄层色谱法，初探对酪氨酸酶活性的影响。
1 材料
1.1 药材山慈姑药材购自贵州省黔东南州信邦中药饮片有限责任公司；白及、金果榄、丽江山慈姑药材购自贵州省药材公司。由贵州省黔东南州信邦中药饮片有限责任公司贺定祥鉴定。
1.2 试剂和仪器L-多巴，蘑菇酪氨酸酶(Sigma公司产品)，酪氨酸(从山慈姑中分离得到)，其它试剂均为市售分析纯。T6新世纪紫外可见分光光度计(北京谱析通用仪器有限责任公司)，FA2004电子分析天平(上海良平仪器仪表有限公司)。
2 方法
2.1 样品的制备山慈姑、白及、金果榄和丽江山慈姑生药粉碎(100目)，各称取4 g，分别用50%乙醇40 ml浸泡14 d。过滤，取续滤液1 ml，用pH 6.8磷酸缓冲液定容至25 ml，备用。
2.2 酪氨酸酶活性测定参照Matsuda等［5］报道方法。分别取上述样品液2 ml，依次加入0.004 mol/L的L-多巴反应液2 ml与蘑菇酪氨酸酶2 ml(200 U)，混合，立即置分光光度计上于475 nm处测吸收值，每分钟记录一次，连续记录20 min。同时，以pH 6.8磷酸缓冲液作为空白对照。酪氨酸酶激活率按下列公式计算。
激活率（%）=［(C-D)/t-(A-B)/t］/(A-B)/t×100%。
其中，A=A475-药+酶； B= A475-药-酶；C= A475+药+酶；D= A475+药-酶，t为相对应的时间。
2.3 数据处理和统计方法采用配对计量资料t检验，实验重复3次。
2.4 薄层层析分别取白及、金果榄、山慈姑、丽江山慈姑、酪氨酸溶液点样于同一块硅胶薄层板上，编号为1、2、3、4、5。以正丁醇-水-乙酸(4∶1∶1)为展开剂，展开，晾干。喷以1%茚三酮乙醇溶液，吹干，显色。
3 结果
3.1 山慈姑和丽江山慈姑均有激活酪氨酸酶活性的作用，金果榄的作用不明显，白及则显示抑制酪氨酸酶活性的作用见表1。表1 山慈姑及伪品提取物对酪氨酸酶活性的激活率（略）
3.2 经显色后，在相同位置处，酪氨酸、金果榄、山慈姑和丽江山慈姑有一紫色斑点，白及则没有。表明金果榄、山慈姑和丽江山慈姑中有酪氨酸存在见图1。
4 讨论
通过山慈姑及其伪品对酪氨酸酶激活率的比较，山慈姑的活性最强，丽江山慈姑次之，金果榄几乎无活性，白及则显示抑制作用。这对临床上治疗色素障碍性皮肤病药物选用时，具有一定的指导作用。
由薄层鉴定可知，酪氨酸是山慈姑、丽江山慈姑激活酪氨酸酶活性作用的主要成分之一；白及中不含酪氨酸，且由于其它成分的存在呈现抑制作用。
作者对呈现抑制作用的白及组中加入一定量的酪氨酸(其它条件相同)，在475 nm处测量，抑制率为-11.88%。加入酪氨酸后虽然降低了抑制率，但并没有达到预期使其激活的效果。因此，酪氨酸含量的高低与激活作用是否呈正比关系，还有待进一步深入的研究。
中药成分十分复杂，酪氨酸也并非为激活酪氨酸酶活性的唯一化合物。据文献报道，咖啡酸也具有激活酪氨酸酶的作用［6］，黄芪中的山柰素［7］、女贞子中的酪醇和齐墩果酸［8］是它们显示激活作用的主要成分。中药治疗白癜风等皮肤病的作用原理，至今仍不清楚。每个具有激活作用的化合物之间是否存在共同点，作用机理如何，都值得进行探讨
【参考文献】
［1］查日煌.中医药治疗白癜风的新进展［J］.甘肃中医,2008,21（3）: 57.
［2］王倩,蔡念宁.中西药对白癜风发病机制中酪氨酸酶调控的研究现状［J］.北京中医,2007,26(5) :317.
［3］闫军,李昌生.21味中药对酪氨酸酶活性影响的研究［J］.中药材, 2002,25(10): 724.
［4］刘邦强,王业发,余淑芳，等.同名异科慈菇真伪品鉴别比较［J］.中国民族民间医药杂志,2005,2:111.
［5］Matsuda H,Higashino M,Nakai Y,et al.Studies of cuticle drugs from natural sources,IV.Inhibitory effects of some Arctostaphylos plants on melanin biosynthesis［J］.Biol Pharm Bull,1996,19:153.
［6］邓湘庆,龚盛昭.咖啡酸激活酪氨酸酶催化反应的动力学研究［J］.食品科学,2008,29 (04):98.
［7］谭城,朱文元,鲁 严.山柰素等7种中药单体对酪氨酸酶的激活作用［J］.临床皮肤科杂志,2006,35(5):275.
［8］张迪敏,李永伟.女贞子对培养的黑素细胞酪氨酸酶活性和黑素合成的影响［J］.中华皮肤科杂志,2006,39(4):197.
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