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中国人基因变构IL-2重组克隆的构建

【中医学院毕业论文】【摘要】 目的 构建基因变构IL-2( 88 N→R)的重组克隆。方法 将正常人的扁桃体细胞经PHA刺激后,获得cDNA文库,并以此为模板,经套式PCR扩增得IL-2的基因编码序列。测序确认正确后,设计含有突变位点的引物,经PCR定点诱变技术获得变构IL-2克隆并进行序列测定。结果 IL-2基因定点诱变成功,并获得了基因变构IL-2( 88 N→R)重组克隆。结论 IL-2重组基因变构克隆的构建为进一步在原核和真核细胞中表达以及研究制备低毒、高效的新型基因变构IL-2奠定了基础。
关键词 白细胞介素-2 DNA 重组 诱变
Clone construction of a site-specific gene
mutant of the human interleukin-2
【Abstract】 Objective To construct clones of a site-specific mutagenesis( 88 N→R)of human interleukin-2(IL-2)gene.Methods Nested-PCR was employed to amplify gene coding for IL-2from the PHA-stimulated human tonsil cell cDNA.Then the specific primers containing the mutated base were synthesized to obtain the target fragments by the means of recombinant PCR.The amplified fragments were cloned to pGEM-T Easy vector and transˉformed into E.coli.JM109.We got the positive clone by blue/white screening.Results The mutated IL-2gene clone was obtained s
uccessfully.Conclusion The construction of the recombinant clone has provided backgrounds for its prokaryotic and eukaryotic expression,which will preparing a kind of low-toxic,high-efficiency drug.
Key words interleukin-2 DNA recombinant mutagenesis
白细胞介素-2(IL-2),是1976年Morgan等 [1] 首先在外周血淋巴细胞中发现的。分泌性的IL-2是相对分子量为14000~17000的糖蛋白,人IL-2由位于第4号染色体长臂上的单一非等位基因编码,由153个氨基酸组成,包括20个信号肽 [2] 。1983年Taniguchi等 [3] 和Devos等 [4] 分别成功地从转化和非转化的T细胞中克隆到人IL-2的cDNA。IL-2具有多种与免疫功能强化有关的生物学活性 [5~7] ,其制剂已用于治疗肿瘤、免疫缺陷和感染性疾病并取得了显著的效果 [7] 。但重组IL-2制剂在临床使用过程中,显示出抗肿瘤的活性不够特异等问题,另外也伴随着对正常细胞的毒性 [8] 。在基因水平对IL-2进行特定位点的定位诱变,产生相应的重组基因变构IL-2,可提高活性而降低毒性[8,9] 。我们成功地诱变IL-2编码基因,使其第88位氨基酸由天冬酰胺(Asn)变构为精氨酸(Arg),并获得了变构的基因克隆。
1 材料和方法
1.1 材料与试剂 菌株E.coli JM109为本室保存。质粒pGEM-T Easy载体、PCR所用试剂、T4DNA连接酶、PCR产物纯化试剂盒均购自Promega公司。TRIZOL试剂购于上海生工公司。利用DNASTAR软件设计的克隆引物均由上海生工公司合成。
1.2 cDNA文库建立 将1例健康中国男性的扁桃体细胞经细胞筛单细胞化后用PHA刺激培养48h,收获细胞后用TRIZOL试剂常规提取总RNA,并反转录成cDNA后-20℃保存。
1.3 IL-2编码基因的克隆构建 以cDNA为模板行套式PCR。外套上游引物(P1):5′-ATTAACCTCAACTCˉCTGCCACAATG-3′,下游引物(P2):5′-TTTGGGATAAATAAGGTAAACCA-3′,内套上游引物(P3):5′-ACAATGTACAGGATGCAACT-3′,下游引物(P4):5′-TAATTATCAAGTTAGTGTTGA-3′。反应条件:94℃,30s,55℃,30s,72℃,45s,35个循环。PCR扩增产物琼脂糖凝胶电泳鉴定。产物纯化后连至T-Easy Vector,转入E.coli JM109中,蓝白斑选择阳性克隆,并进行PCR、酶切鉴定。
1.4 IL-2变构基因的克隆构建 设计含突变位点的引物P5、P6。P5:5′-GACTTAATCAGCCGTATCAACGTAATA-3′,P6:5′-TATTACGTTGATACGGCTGATTAAGTC-3′。经PCR定点诱变技术得到变构基因片段P3/P6、P5/P4,将两片段纯化后以P3、P4扩增获得变构基因,纯化后与T-Easy Vecˉtor连接,重组质粒标记为T-Easy/IL-2(sa),转化E.coli JM109,蓝白斑选择阳性克隆,并进行PCR、酶切鉴定。
1.5 IL-2编码基因与变构基因的测序 将鉴定为阳性的IL-2的编码基因克隆和基因变构克隆送至上海生工公司进行序列测定。
2 结果
2.1 目的基因的PCR扩增 IL-2编码基因经PCR扩增产生了472bp的条带,见图1。
图1 PCR产物及重组质粒的酶切鉴定(略)
2.2 重组变构质粒的酶切鉴定 将重组质粒T-Easy/IL-2(sa)经EcoRⅠ酶切后电泳可看到两条电泳带,分别为3.0kb和470bp左右,证明克隆构建成功。
2.3 序列测定结果 见序列1,2。
3 讨论
IL-2是20世纪90年代获准上市的重组基因工程药物。在自然状态下,IL-2是由体内参与免疫调节的细胞分泌的细胞因子,其本质是蛋白质(多肽),具有多种与免疫功能强化有关的生物学活性 [5~7] ,可以刺激机体的CTL细胞和NK细胞产生干扰素,这种内源性的干扰素可以使得单核-巨噬细胞发生活化,产生肿瘤坏死因子(TNF),TNF可以导致肿瘤细胞的程序性死亡 [8] 。
ATG TAC AGG ATG CAA CTC CTG TCT TGC ATT GCA CTA AGT CTT GCA CTT 48
M Y R M Q L L S C I A L S L A L
GTC ACA AAC AGT GCA CCT ACT TCA AGT TCT ACA AAG AAA ACA CAG CTA 96
V T N S A P T S S S T K K T Q L
CAA CTG GAG CAT TTA CTT CTG GAT TTA CAG ATG ATT TTG AAT GGA ATT 144
Q L E H L L L D L Q M I L N G I
AAT AAT TAC AAG AAT CCC AAA CTC ACC AGG ATG CTC ACA TTT AAG TTT 192
N N Y K N P K L T R M L T F K F
TAC ATG CCC AAG AAG GCC ACA GAA CTG AAA CAT CTT CAG TGT CTA GAA 240
Y M P K K A T E L K H L Q C L E
GAA GAA CTC AAA CCT CTG GAG GAA GTG CTA AAT TTA GCT CAA AGC AAA 288
E E L K P L E E V L N L A Q S K
ACC TTT CAC TTA AGA CCC AGG GAC TTA ATC AGC AAT ATC AAC GTA ATA 336
T F H L R P R D L I S N I N V I
GTT CTG GAA CTA AAG GGA TCT GAA ACA ACA TTC ATG TGT GAA TAT GCT 384
V L E L K G S E T T F M C E Y A
GAT GAG ACA GCA ACC ATT GTA GAA TTT CTG AAC AGA TGG ATT ACC TTT 432
D E T A T I V E F L N R W I T F
TGT CAA AGC ATC ATC TCA ACA TCA ACT 459
C Q S I I S T L T
序列1 IL-2编码基因核苷酸序列及对应153个氨基酸的序列
ATG TAC AGG ATG CAA CTC CTG TCT TGC ATT GCA CTA AGT CTT GCA CTT 48
M Y R M Q L L S C I A L S L A L
GTC ACA AAC AGT GCA CCT ACT TCA AGT TCT ACA AAG AAA ACA CAG CTA 96
V T N S A P T S S S T K K T Q L
CAA CTG GAG CAT TTA CTT CTG GAT TTA CAG ATG ATT TTG AAT GGA ATT 144
Q L E H L L L D L Q M I L N G I
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GAA GAA CTC AAA CCT CTG GAG GAA GTG CTA AAT TTA GCT CAA AGC AAA 288
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GAT GAG ACA GCA ACC ATT GTA GAA TTT CTG AAC AGA TGG ATT ACC TTT 432
D E T A T I V E F L N R W I T F
TGT CAA AGC ATC ATC TCA ACA TCA ACT 459
C Q S I I S T L T
序列2 IL-2的核苷酸及对应氨基酸序列
(注:直线标记处为诱变位点)
IL-2与受体结合后发挥作用,由三种肽链α、β、γ参与构成亲和力不同的受体 [4,8] ,IL-2Rα链只与IL-2结合 [6] 。T细胞表面表达由α、β、γ三聚体构成的高亲和力受体,NK细胞表面表达由β、γ二聚体构成的中亲和力受体 [10] 。随着研究的进展,发现IL-2对于其靶受体的选择性不高,在与中亲和度受体结合后,会导致NK细胞的过度活化,从而产生过量肿瘤坏死因子,杀伤正常细胞 [6] 。经过近10年的探索发现:在基因水平对IL-2进行特定位点的定位诱变,产生相应的重组基因变构IL-2。部分重组基因变构IL-2对机体抗肿瘤免疫的主要细胞-CTL细胞的活性作用较原有的IL-2强约3000倍 [6] 。部分变构体大大增加了原有IL-2的活性 [9] ,因而预见,如将IL-2变构体发展为临床用药将会是高效低毒的。鉴于继发肿瘤是肿瘤病人死亡的主要原因,实验证实在鼠模型中基因变构IL-2( 88 N→R)能抑制肿瘤转移 [8] 。同时研究还证明IL-2对于HIV引起的免疫缺陷症有较好的潜在疗效。因此基因变构IL-2将是一个有着良好市场开发前景的一类药物。
我们构建了变构IL-2( 88 N→R)的基因克隆,此工作为今后构建IL-2变构基因的表达克隆,在原核和真核细胞中表达及制备低毒、高效的新型IL-2基因重组生物制剂将奠定基础。
参考文献
1 Morgan DA.Ruscetti.Selective in vitro growth of T lymphocytes from normalhuman bone marrows.Science,1976,193:1007-1008.
2 Gillis S Ferm.The in vitro generation and sustained culture of nude mouse cytototic T-lymphocytes.J Exp Med,1979,149:1960-1976.
3 Taniguchi,Matsui H,Fujita T,et al.Structure and expression of cloned cDNA for human interleukin-2.Nature,1983,302:305-310.
4 Devos R,Plaetinck G,Cheroute H,et al.Molecular cloning of human inˉterleukin-2cDNA and its expression in E.coli.Nucl Acids Res,1983,11:4307-4323.
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6 孙卫民,王惠琴.细胞因子研究方法学.北京:人民卫生出版社,1999,387-408.
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