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HPLC测定桂枝汤不同配伍中桂皮酸和桂皮醛的含量
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【药学本科毕业论文】【摘要】 建立HPLC法测定桂枝汤中桂皮酸和桂皮醛含量的分析方法，研究配伍对桂枝汤中桂皮酸和桂皮醛含量的影响。［方法］采用L16（215）正交设计，以HPLC法测定桂皮酸和桂皮醛含量。［结果］不同配伍对桂枝汤中桂皮酸、桂皮醛含量有影响。［结论］该方法测定样品成分含量方法准确，敏捷，数据可靠，为药效学提供了科学定量依据。
【关键词】 桂枝汤；桂皮酸；桂皮醛；配伍；HPLC法
本研究引入正交设计,合理安排方中甘草、芍药、大枣、生姜与桂枝配伍，采用HPLC法,测定了桂枝与方中其它药物配伍后，其主要成分的含量变化，为进一步研究桂枝汤的含量测定、配伍规律、作用机制等提供参考。
1 药品与材料
1.1 仪器
Agilent 1100 Series高效液相色谱仪；METTLER AE240电子分析天平；SB3200超声波清洗器。
1.2 试剂
流动相乙腈为色谱纯；水为重蒸馏水；其它试剂均为分析纯。桂皮酸、桂皮醛对照品由昆明海升林科技有限公司提供（批号分别为110786200503，110710200714，供含量测定）。
1.3 中药材
桂枝、芍药、甘草、生姜、大枣由宜昌市众生药业有限公司提供（经宜昌市药品检验所魏俊德主任药师鉴定上述药材符合2005年同家药典）。
2 方法与结果
2.1 色谱条件
色谱柱为NVCLEOSIL C18（10μm，4.6mm×250mm），流动相为乙晴0.1%醋酸水溶液（33∶67），检测波长为285nm，柱温为35℃，流速为1.0ml·min,进样量为10μl［2］。在此条件下，对照品和样品色谱图见图1和图2。
2.2 对照品及供试品溶液的制备
2.2.1 对照品溶液的配制
精密称取桂皮酸、桂皮醛对照品适量，分别置于100ml容量瓶中，加甲醇溶解并稀释到刻度，摇匀，放置，滤过，作为贮备液。另取贮备液5ml，加甲醇稀释至100ml，制成每1ml含桂皮酸44μg的对照品溶液。
2.2.2 供试品溶液的制备
按桂枝汤配方比例，精密称取桂枝9g，芍药9g，炙甘草6g， 生姜9g，大枣4枚，加药材5倍水，加热回流2h，四层纱布过滤，精密量取2ml, 置10ml容量瓶中，加甲醇定容至10ml,滤液放冷后过0.45μm微孔滤膜，得供试品溶液。
2.2.3 标准曲线
精密量取桂皮酸和桂皮醛对照品溶液各2μl、4μl、6μl、8μl、10μl、12μl，分别注入高效液相色谱仪，以浓度(X)为横坐标，色谱峰面积(Y)为纵坐标，求得回归方程：桂皮酸和Y=7387.25x+9.467 r=0.9999(n=6)、桂皮醛Y=9485.24x+22.414 r=0.9999(n=6)。表明桂皮酸在88.5μg·ml～531μg/ml、桂皮醛在95.14μg/ml～570.8μg/ml范围内线性良好。
2.2.4 精密度试验
精密量取对照品溶液各10μl，连续进样5次，按上述色谱条件进样测定，所得峰面积分别是桂皮酸：3281、3222、3280、3280、3283，RSD=0.8%（n=5）；桂皮醛：4584、4504、4576、4578、4575，RSD=0.8%（n=5）。
2.2.5 重复性试验
取某一份供试品溶液，按照2.2.3项下“精密量取2ml”同法操作，平行制备5份供试品溶液，分别于2、4、6h测定桂皮酸和桂皮醛的峰面积，峰面积分别为桂皮酸：2167、2175、2175，RSD=0.2%（n=3）；桂皮醛8919、8891、8887，RSD=0.2%（n=3）。表明供试液在6h内稳定。
2.2.6 稳定性试验
取某一份供试品溶液，在配制后0，2，4，6，8，12h进样，测定桂皮酸、桂皮醛含量，其RSD=0.2%，表明6h内溶液稳定。
2.2.7 加样回收率测定
精密称取桂枝0.8g，分别于10 ml量瓶中.精密加入浓度为桂皮酸对照液1ml.按照2.2.3项下同法操作，依次测定含量，桂皮酸平均回收率为99.9%，RSD=0.1%（n=5）、桂皮醛平均回收率为91.8%，RSD=1%（n=5）。
2.3 实验方案
为考察芍药、甘草、生姜、大枣及两两协同作用对桂皮酸、桂皮醛含量的影响，合理安排各因素、因素水平，采用正交设计安排试验。设置四因素，两水平，以桂皮酸、桂皮醛含量作为考察指标。用L16（215）作表头设计：
2.3.1 因素水平 见表1。表1 因素水平表（略）
2.3.2 实验结果
供试品溶液的制备按2.2.2项下方法，试验安排及测定结果见表2。表2 试验安排及结果（略）
3 讨论
配伍是中医用药的特色和优势所在，开展方剂配伍规律的现代研究是中医药现代化研究的重要组成部分，对于继承和发展中药配伍理论，更有效地指导临床和中药新产品创研具有重要意义。而方剂物质基础研究又是方剂配伍研究的核心内容、关键环节［3］。HPLC分析结果表明，配伍芍药、甘草、生姜、大枣均可不同程度地影响桂皮酸和桂皮醛的含量，说明不同配伍情况下处方中所含化学成分在发生变化。进一步说明,中药汤剂在制备过程中,各配伍药材所含化学成分之间在受热条件发生了复杂的理化反应,这种复杂的理化反应正是桂皮酸的含量发生变化的主要原因。本实验模拟临床实际用药，在直火煎煮和浓缩的情况下，桂枝中所含挥发油成分易挥发，其含量降低，特别是桂皮醛［4］，故建议桂枝汤的煎煮应在文火、加盖的情况下长时间煎煮。
【参考文献】
1］林哓波.古方新用桂枝汤［J］.中医中药,2007,11(4):62.
［2］毛永明，叶福媛，张钰泉.桂枝汤多指标定量法HPLC条件的研究［J］.上海中医药杂志,2007,41(7):7274.
［3］王艳伟，熊赣平，杨中林.增液汤不同配伍对梓醇含量的影响［J］.海峡药学,2006,18(2):4345.
［4］毛永明，叶福媛，张钰泉，等.桂枝汤多指标定量法［J］.中国医院药学杂志,2006,26(2):170172.
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