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纤维素酶用于山茱萸提取的初步研究
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【专科药学毕业论文】作者：王新胜，吴艳芳，黄年华【摘要】 目的对酶法提取山茱萸总皂苷的酶解条件进行了初步研究，考察了酶解时间、酶用量、酶解温度和酶解初始pH值对总皂苷产量的影响。方法采用紫外可见分光光度法测定总皂苷含量，检测波长为554 nm。结果确定了酶解的最优条件为:酶解时间为150 min,酶量为5 U/g，酶解温度为45℃，酶解初始pH=5.4。结论酶法能显著提高山茱萸总皂苷的提取率。
【关键词】 山茱萸 纤维素酶 提取
Abstract：ObjectiveA new technology of extracting total saponins from Fructus Corni with cellulose enzyme was studied in this experiment. The influence of enzymolysis time, enzyme amount, enzymolysis temperature, and pH of the enzyme solution was studied. MethodsThe content of total saponins in Fructus Corni determined by UV-spectrophoto-metry with a detection wavelength at 554 nm. ResultsThe experiment showed an optimum process: enzymolysis time was 150 min，enzyme amount was 5U/g, enzymolysis temperature was 45℃ and pH of enzyme solution was 5.4. ConclusionThe extraction percentage of total saponins from Fructus Corni can be improved by cellulose enzyme treatment.
Key words：Fructus Corni; Cellulose enzyme； Extraction
山茱萸为山茱萸科植物山茱萸Cornus officinalis Sieb. et Zucc的干燥成熟果肉，具有补益肝肾、涩精固脱的功能［1］。化学成分分析表明，山茱萸果实中含有大量维生素、各种氨基酸、环烯醚萜苷类、皂苷、熊果酸、齐墩果酸等药用及营养保健成分［2］。近年研究发现山茱萸总皂苷具有较强的免疫抑制作用，是山茱萸作为免疫抑制的主要有效成分［3］。为了提高山茱萸总皂苷的利用率，充分发挥其功效，人们研究了许多山茱萸总皂苷的提取方法［4～6］。这些传统方法在一定的程度上提取了总皂苷，但效果不尽理想。目前，酶法已广泛应用于植物有效成分的提取中，并已显示出其优越性。本文把纤维素酶用于山茱萸提取的研究，现报道如下。
1 材料与仪器
纤维素酶，购于北京双旋微生物培养基制品厂；人参皂苷Re购于中国药品生物制品检定所；冰醋酸，莱阳市双双化工有限公司，高氯酸，天津市东方化工厂，香草醛、甲醇，天津市富宇精细化工公司，试剂均为分析纯；山茱萸药材，产地河南洛阳地区，经鉴定均来源于山茱萸科植物的成熟果实；上海精密仪器厂722型分光光度计。
2 方法
2.1 山茱萸中总皂苷提取工艺称取山茱萸原料5.000 g，置于100 ml圆底烧瓶中，酶解，反应一定时间后取出趁热过滤，收集滤夜，浓缩蒸干后，用甲醇溶解定容10 ml容量瓶中，作为储备液，备用。
2.2 含量测定吸取“2.1”项下的储备液10μl于具塞试管中，70℃水浴蒸干，精密加入0.2 ml 50 g·L-1香草醛冰醋酸溶液和0.8 ml高氯酸，振摇混匀后于65℃水浴加热20 min，冰水冷却5 min，加冰醋酸5 ml摇匀，以相同试剂为空白对照，在波长554 nm处测定吸光度，以标准曲线法计算总皂苷含量。
3 结果与讨论
3.1 标准曲线的绘制及线形范围精密称取人参皂苷Re对照品5.000 mg，以甲醇溶解并定容于5 ml容量瓶中，配制成1 mg/ml的对照品溶液。分别精密吸取该溶液50，70，100，150，170，200，250 μl，置10 ml具塞试管中，按“2.2”项下操作。以吸光度对浓度进行回归，方程为A=16.084C-0.013，相关系数r=0.999 8。表明总皂苷在0.008 3～0.041 7 mg/ml的浓度呈良好的线性关系。
3.2 酶法回流提取与直接回流提取的比较称取5 g山茱萸粉末两份，加十倍量的95%乙醇，一份加1 g 左右的纤维素酶，调pH值5.0左右，在温度50℃回流2 h，蒸干溶剂，按照“2.2”项下测定其A值，并计算结果，见图1。
从图1可以看出在纤维素酶的作用下，提高了总皂苷的含量和产率，这是因为纤维素酶可以破坏植物的细胞壁而使有效成分提取率提高，使药材得到充分利用，纤维素酶应用于中药有效成分的提取越来越显示出其有效性。
3.3 酶解时间的影响在酶解初始pH、酶量和酶解温度一定的条件下，考察不同酶解时间对山茱萸总皂苷提取含量的影响，结果见图2。
从图2可以看出，在酶解初始pH值、酶解温度和酶量一定的条件下，总皂苷产量先随酶解时间的增加而增加，150 min时达到最大值。这是因为随着时间的延长，酶活力得到充分的利用，酶解反应进行得较完全，随着酶解时间的增加总皂苷产量几乎不变。因此150 min为最佳酶解时间。
3.4 酶量的影响在酶解初始pH、酶解时间和酶解温度一定的条件下，考察酶量对山茱萸总皂苷提取含量的影响，结果见图3。
从图3可以看出，在酶解液初始pH值、酶解时间和酶解温度一定的条件下，总皂苷产量先随酶量的增加而增大，在酶量为5 U/g时，总皂苷产量达最大值，此后急剧下降而趋于平衡。这是因为在一定实验条件下，酶量低于最佳值时，酶解未进行完全，底物过量，致使总皂苷产量不高，达到最佳值时，酶解进行得较彻底，此时如果继续增加酶量，酶解进行程度不会增加反而下降，具体原因有待进一步研究。因此，综合各方面因素，确定在实验条件下酶解提取辣椒素的酶量最佳值为5 U/g。
3.5 酶解温度的影响在酶解初始pH、酶量和酶解时间一定的条件下，考察酶解温度对山茱萸总皂苷提取含量的影响，结果见图4。
从图4可以看出，在其它条件固定的情况下，总皂苷产量先随酶解温度升高而增加，在40℃时为最大值，40℃后温度再升高，总皂苷含量减小。这是因为温度影响酶活性具有双重效应，温度升高时反应速度也加快，同时也加速酶变性失活。最适温度以下时前者占优势，最适温度以上时后者起主导作用，因此，酶解温度高于最适温度40℃，酶活性迅速丧失，总皂苷产量减少。
3.6 pH值变化的影响在酶量1、酶解温度和酶解时间一定的条件下，考察pH值对山茱萸总皂苷提取含量的影响，结果见图5。
从图5可以看出，在其它条件一定的情况下，总皂苷产量先随酶解初始pH 值的增大而增大，在pH=4.5时达到最大值，当pH值达到4.5后再增加酶解初始pH值，总皂苷产量反而随pH值的增大而减小。这是因为pH值会影响底物分子的解离状态，也会影响酶分子的解离状态，最适pH与酶活力中心结合底物的基团及参与催化的基团的pK值有关，往往只有一种解离状态最有利于与底物结合，在此pH下酶活力最高。在本实验中，pH值为4.5时该纤维素酶酶活最高，总皂苷产量最高。
4 结论
利用酶法提取山茱萸总皂苷，能显著提高提取率；纤维素酶可以用于山茱萸总皂苷提取，方法简单方便，适于工业化生产。
酶法提取山茱萸总皂苷的最佳酶解条件是：酶解时间150 min，酶量5 U/g，酶解温度40°，酶解pH=4.5。
【参考文献】
［1］周京华，李春生，李电东.山茱萸有效化学成分的研究进展［J］.中国新药杂志，2001，10(11)：808.
［2］呼世斌，冯贵颖，曹社会. 山茱萸的营养成分和保健作用［J］.西北农业大学学报，1996，24(6)：108.
［3］李建民，周 勇，项静辰. 山茱萸总甙对正常小鼠T 淋巴细胞免疫功能影响的实验研究［J］.北京中医药大学学报，2000，23（6）：197.
［4］臧 晋，薛 刚，邱永军. 山茱萸中总皂甙提取条件研究［J］.食品工业科技，1997，2：26.
［5］韩志慧，张景伟，赵玉丛，等.7种山茱萸总皂苷提取分离方法效果比较［J］.郑州大学学报（医学版），2005，40（5）：466.
［6］励建荣，夏道宗.超声波和溶剂法提取山茱萸中总皂甙的工艺研究［J］.食品科学，2005，26（4）：198.
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