| 摘要 | 第6-7页 |
| abstract | 第7-8页 |
| 第一章 引言 | 第14-27页 |
| 1.1 猪流行性腹泻病毒(PEDV)研究进展 | 第14-18页 |
| 1.1.1 PEDV概述 | 第14页 |
| 1.1.2 PEDV基因组和结构 | 第14-15页 |
| 1.1.3 PEDV感染细胞模型 | 第15-16页 |
| 1.1.4 PEDV发病机制和调节宿主先天性免疫应答 | 第16-18页 |
| 1.2 肠类器官的研究进展 | 第18-20页 |
| 1.3 IFN-λ在病毒感染和抗病毒免疫中的作用 | 第20-25页 |
| 1.3.1 IFN-λ概述 | 第20页 |
| 1.3.2 IFN-λ分类 | 第20-21页 |
| 1.3.3 病毒感染期间IFN-λ的表达 | 第21页 |
| 1.3.4 IFN-λ受体表达和信号转导 | 第21-23页 |
| 1.3.5 IFN-λ的抗肠道病毒作用 | 第23-25页 |
| 1.4 研究目的与意义 | 第25-27页 |
| 第二章 PEDV感染肠类器官模型的建立及IFN-λ抗 PEDV的研究 | 第27-51页 |
| 2.1 实验材料 | 第28-29页 |
| 2.1.1 细胞与毒株 | 第28页 |
| 2.1.2 实验用动物 | 第28-29页 |
| 2.1.3 主要试剂 | 第29页 |
| 2.1.4 主要仪器 | 第29页 |
| 2.2 实验方法 | 第29-36页 |
| 2.2.1 3D肠道隐窝干细胞分离培养 | 第29-30页 |
| 2.2.2 猪肠类器官传代 | 第30-31页 |
| 2.2.3 肠类器官细胞冻存 | 第31页 |
| 2.2.4 肠类器官细胞复苏 | 第31页 |
| 2.2.5 2D单层肠类器官培养 | 第31页 |
| 2.2.6 PEDV感染2D肠类器官细胞或Vero E6 细胞 | 第31-32页 |
| 2.2.7 细胞总RNA提取和反转录 | 第32页 |
| 2.2.8 实验用引物设计 | 第32-33页 |
| 2.2.9 实时荧光定量PCR(qPCR) | 第33-34页 |
| 2.2.10 TCID_(50)检测 | 第34页 |
| 2.2.11 PEDV感染仔猪动物实验 | 第34页 |
| 2.2.12 苏木精和伊红染色 | 第34-35页 |
| 2.2.13 免疫组织化学实验 | 第35页 |
| 2.2.14 间接免疫荧光(IFA)检测 | 第35-36页 |
| 2.2.15 数据分析 | 第36页 |
| 2.3 实验结果 | 第36-48页 |
| 2.3.1 猪源小肠隐窝干细胞可在体外培养分化成小肠类器官 | 第36-37页 |
| 2.3.2 猪肠类器官可进行连续传代和冻存复苏培养 | 第37页 |
| 2.3.3 2D单层肠类器官包含成熟肠道上皮细胞的各种细胞谱系 | 第37-38页 |
| 2.3.4 2D单层小肠类器官对PEDV敏感 | 第38-40页 |
| 2.3.5 PEDV感染回肠类器官导致明显的细胞病变效应 | 第40页 |
| 2.3.6 PEDV可感染回肠类器官中多种类型的细胞 | 第40-41页 |
| 2.3.7 体内验证PEDV可感染回肠组织中的不同细胞谱系 | 第41-42页 |
| 2.3.8 结肠隐窝干细胞可在体外培养分化成结肠类器官 | 第42-43页 |
| 2.3.9 PEDV-JMS在回肠类器官中比结肠类器官中复制地更好 | 第43-44页 |
| 2.3.10 体内验证PEDV限制性感染结肠组织 | 第44页 |
| 2.3.11 回肠类器官可支持其他PEDV毒株(PEDV CV777)进行复制 | 第44页 |
| 2.3.12 临床毒株PEDV-JMS比细胞适应毒株PEDVCV777 在回肠类器官上复制更好 | 第44-45页 |
| 2.3.13 PEDV感染抑制回肠类器官内先天性IFN反应 | 第45-47页 |
| 2.3.14 回肠类器官可对IFN产生免疫反应 | 第47页 |
| 2.3.15 IFN-λ1和IFN-α抑制PEDV在回肠类器官上的感染 | 第47-48页 |
| 2.4 讨论 | 第48-51页 |
| 第三章 IFN-λ在猪小肠上皮细胞中诱导抗病毒转录谱富集分析及鉴定 | 第51-74页 |
| 3.1 实验材料 | 第52-53页 |
| 3.1.1 细胞与毒株 | 第52页 |
| 3.1.2 主要试剂 | 第52-53页 |
| 3.1.3 主要仪器 | 第53页 |
| 3.2 实验方法 | 第53-58页 |
| 3.2.1 PEDV感染IPEC-J2细胞 | 第53-54页 |
| 3.2.2 细胞总RNA提取和反转录 | 第54页 |
| 3.2.3 实验用引物设计 | 第54-55页 |
| 3.2.4 实时荧光定量PCR检测 | 第55页 |
| 3.2.5 TCID_(50)检测 | 第55页 |
| 3.2.6 间接免疫荧光(IFA)检测 | 第55页 |
| 3.2.7 IPEC-J2细胞转录组测序样品准备 | 第55-56页 |
| 3.2.8 微矩阵分析 | 第56页 |
| 3.2.9 真核重组表达质粒pMX2-pCAGGS-HA和 pRSAD2-pCAGGS-HA构建 | 第56-58页 |
| 3.2.10 重组质粒蛋白表达验证 | 第58页 |
| 3.2.11 pMX2和pRSAD2蛋白对PEDV的作用 | 第58页 |
| 3.2.12 数据分析 | 第58页 |
| 3.3 实验结果 | 第58-72页 |
| 3.3.1 外源性IFN-λ3在IPEC-J2细胞中对PEDV的抑制作用强于IFN-α | 第58-59页 |
| 3.3.2 IFN-λ3在IPEC-J2细胞中诱导独特的转录谱 | 第59-61页 |
| 3.3.3 IFN-λ3对小肠上皮细胞的生物功能的影响要强于IFN-α | 第61-65页 |
| 3.3.4 IFN-λ3比IFN-α激活了更多的信号通路 | 第65-66页 |
| 3.3.5 IFN-λ3与IFN-α相比在IPEC-J2细胞中诱导特异性基因表达 | 第66-68页 |
| 3.3.6 IFN-λ3在小肠上皮细胞上诱导的基因差异表达比IFN-α更显著 | 第68-69页 |
| 3.3.7 IFN-λ3在小肠类器官上诱导的基因差异表达比IFN-α更明显 | 第69-70页 |
| 3.3.8 pMX2和pRSAD2抑制Vero E6细胞中的PEDV感染 | 第70-72页 |
| 3.4 讨论 | 第72-74页 |
| 第四章 全文结论 | 第74-75页 |
| 参考文献 | 第75-87页 |
| 致谢 | 第87-88页 |
| 作者简历 | 第88页 |
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