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β分泌酶原核表达载体的构建、表达及融合蛋白纯化
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【西药科研论文】作者：朱爱华 李敬 陆军 钱进 郑元林【摘要】 目的 构建小鼠β分泌酶原核表达载体并诱导其表达和纯化，为进一步研究β分泌酶的作用奠定基础。方法 根据基因文库中小鼠β分泌酶基因的cDNA序列设计引物，采用RTPCR方法扩增到β分泌酶的cDNA片段，克隆进原核表达载体pET28a中，并转化大肠杆菌BL21(DE3)，测序鉴定后，通过IPTG诱导表达出目的蛋白，经亲合层析纯化。结果 从小鼠的脑组织RNA中扩增出特异的β分泌酶基因片段长1 506 bp，经酶切鉴定及DNA序列测定，证实重组载体pET28aBACE构建正确，表达融合蛋白分子量约为55 kD，经镍离子亲合柱层析纯化获得电泳级纯度的目的蛋白。结论 在大肠杆菌中获得了小鼠β分泌酶的高效表达，为进一步研究其生物学功能和应用奠定了基础。
【关键词】 β分泌酶；大肠杆菌；表达；融合蛋白
【Abstract】Objective To build mice β secretase prokaryotic expression vector and induce its expression and purification, to afford basis for β secretase research. Methods Primer was designed by mice β secretase gene cDNA in Genbank. cDNA segment of β secretase gene was amplified by RTPCR, then cloned into prokaryotic expression vector pET28a and transformed into E. coli BL21(DE3). After sequenced and identified, fusion protein was induced, expressed and purified.Results Special β secretase gene segment amplified from RNA of mice brain tissue was 1 506 bp. After identified and sequenced, recombinant vector was proved correct, its fusion protein had a molecular weight of 55 kD. Electrophoresis purity target protein could be acquired. Conclusions Mice β secretase has a high expression in E. coli, which build a basis for research of β secretase′s biological function and its application.
【Key words】βsecretase; E. coli; Expression; Fusion protein
阿尔茨海默病(AD)是发病率最高，危害最大的中枢神经系统退变性疾病〔1〕。淀粉样斑块是其主要病理特征之一，主要成分β淀粉样蛋白(Aβ)在AD的发生、发展中起着重要作用，因此阻断或延迟AD早期Aβ的积聚成为治疗AD的切入点。β分泌酶(BACE)是淀粉样前体蛋白(APP)水解产生Aβ的关键酶，是干预AD进程的理想靶点〔2〕。通过酵母或昆虫表达系统表达活性BACE在最近已见报道。然而，由于上述系统表达的蛋白量低，不适合BACE抑制剂的大规模筛选〔3，4〕。而BACE的原核表达可克服以上缺陷，为筛选特异性抑制剂及研究BACE结构与功能关系提供大量材料，为最终从根本上治疗AD带来希望。本研究利用大肠杆菌表达系统，选用pET28a作为表达载体获得小鼠BACE，经镍离子固定金属亲和层析纯化目的蛋白，以便进一步研究其功能。
1 材料与方法
1.1 主要材料
2月龄昆明小鼠(购自徐州医学院)；宿主菌E.coli BL21(DE3)(由本实验室保存)；质粒pET28a(购自Novagen公司)；限制性核酸内切酶EcoRⅠ、BamHⅠ、T4 DNA连接酶等工具酶(购自大连宝生物工程公司)；Trizol 试剂及AMV逆转录酶(美国Promega公司)；Pfu DNA聚合酶及溶菌酶(上海生工生物工程公司)；PCR纯化和胶回收试剂盒(购自上海华舜生物工程公司)；DNA marker、中分子量蛋白质marker是 Fermentas公司产品；镍离子亲合层析柱(Novagen公司产品)；其他化学试剂均为分析纯。
1.2 寡核苷引物的设计与合成
根据基因文库中小鼠BACE基因的cDNA序列及相应的限制性核酸内切酶位点设计合成2条引物P1:5′TAGGATCCATGGCCCCAGCGCTGCACT3′(划线部分为BamHⅠ酶切位点)；P2:5′CGGAATTCTTACTTGAGCAGGGAGATGTCA3′(划线部分为EcoRⅠ酶切位点)。 由上海生工生物工程公司合成。
1.3 RTPCR
迅速分离小鼠的大脑皮层组织，Trizol 试剂提取总RNA，反转录后得到cDNA，以P1和P2做为上、下游引物，设置PCR参数：为94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s, 55 ℃ 45 s, 72 ℃ 90 s,循环30次, 72 ℃ 10 min,扩增产物用1%琼脂糖凝胶电泳进行分析,观察片段大小，并纯化PCR产物。
1.4 重组表达载体的构建
将纯化的PCR产物经BamHⅠ和EcoRⅠ双酶切后克隆进入经同样双酶切的pET28a质粒中，获得pET28aBACE重组质粒，并转化DE3感受态细胞，筛选、鉴定阳性克隆。
1.5 融合蛋白的诱导表达
挑取含有质粒pET28aBACE的DE3 一单菌落，接种于50 ml含有50 μg/ml卡那霉素的液体LB培养基中，37℃恒温振荡培养过夜，按1%的接种量接种到新鲜的含50 μg/ml卡那霉素的液体LB培养基中，37℃振荡培养。通过不同的诱导时间和异丙基βD硫代半乳糖苷(IPTG)浓度优化其表达条件，12% SDSPAGE检测目的蛋白的表达。在扩大培养至A600 0.4～0.6时加IPTG使终浓度1 mmol/L，诱导表达5 h后收集菌体。
1.6 融合蛋白的亲合纯化
离心收集诱导后的菌体，溶菌酶裂解后，离心，上清和沉淀分别取样，12% SDSPAGE检测，确定目的蛋白所在部位。镍凝胶亲和层析法纯化目的蛋白，纯化后可得到经SDSPAGE电泳检测，考马斯亮蓝染色单一条带的蛋白。
2 结果
2.1 RTPCR扩增结果
将设计合成的引物，以逆转录合成的小鼠脑组织cDNA为模板,经PCR扩增后，1%琼脂糖凝胶电泳结果显示在1500 bp 左右的有一明显的DNA条带(图1)，与预期大小1 506 bp相符。
2.2 重组表达载体的鉴定
获得的重组质粒进行酶切鉴定，产生预期大小的片段，见图2。通过DNA测序进一步确定成功构建了重组表达载体pET28aBACE，目的基因序列正确。
2.3 重组蛋白的表达
含重组质粒pET28aBACE的DE3经IPTG诱导后1 h出现新的蛋白质，就有融合蛋白的表达(图3)。随着培养时间的延长，融合蛋白的表达量随之增加。但到4 h后融合蛋白的表达达到高峰并处于稳定水平，随着诱导时间的增加没有明显变化。因此，在大规模发酵培养的时候，诱导后继续培养5 h左右就可收获菌体。通过SDSPAGE电泳结果还证实，诱导剂加入4 h后，融合蛋白的表达约占细菌总蛋白的30%左右。表明这一新的融合表达载体能以较高水平表达融合蛋白。
2.4 目的蛋白的纯化
pET表达载体中Histag 可以使融合蛋白利用亲合层析的方法进行分离纯化，将样品处理后和预先处理好的镍凝胶柱结合，经过10、20、100 mmol/L咪唑的逐步洗脱，最后得到电泳纯目的蛋白(图4) ，分子量55 kD左右，与理论值相符。
3 讨 论
本实验选用带有Histag标签的pET28a作为BACE基因融合表达的载体。主要因为：一是该表达系统中的大肠杆菌菌株BL(DE3)补充了大肠杆菌缺乏的6 种稀有密码子(AUA, AGG, AGA, CUA, CCC, GGA)对应的tRNA,能够提高外源基因,尤其是真核基因在原核表达系统中的表达水平；二是构建表达载体的时候将6个组氨酸的核苷酸序列引入到目的蛋白编码的N端，6个组氨酸没有免疫原性，一般不影响蛋白的折叠和干扰重组蛋白的结构和功能，同时,组氨酸靶最大优点是允许重组蛋白固定于金属鏊合表面，利于重组蛋白纯化。
BACE基因定位于11号染色体上，其mRNA有7.0、4.4、2.6 kb三种转录形式，编码501个氨基酸。BACE可以切割APP上的Asp1或Glu1(Aβ上第一位氨基酸)分别释放出其氨基端膜外结构域sAPPβ和sAPPβ、APP的羧基端，即膜结合片段，随后被γ分泌酶作用产生全长的Aβ140/42或氨基端缩短成Aβ1140/42〔5〕。虽然BACE的结构已经清楚，但是究竟是何种原因诱导Aβ经过β分泌酶途径代谢，目前仍在探讨之中。现今如何防止Aβ蛋白, 特别是较疏水的Aβ42蛋白片段的形成, 已成为开发药物治疗AD的热点。因此，对BACE和AD之间的关系进行深入研究，可以进一步对AD的发病机制进行探讨，并对开发研制新的预防和治疗AD的药物提供一定理论基础。
近年来国际上许多研究机构致力研究β分泌酶，以便于寻找抑制Aβ形成的有效措施〔6〕。特别最近出现的RNA干扰技术，使靶向BACE治疗AD越来越受到人们更多的关注和期待。但目前BACE抑制剂治疗AD主要面临两个问题〔7〕，一是BACE广泛分布在体内各种细胞，其作用底物不止APP一种，完全抑制它可能会带来继发性的毒性，并且AD需要长期治疗，这样会加重它的不良反应；二是患者多在出现症状后才确诊，而此时脑内已有大量的Aβ沉积，超过了酶抑制剂的治疗范围。但由于Aβ在AD中的重要作用，只要部分抑制BACE就可以使Aβ水平下降30％～50％，即可有明显疗效，而抑制Aβ的形成也可以有效地清除已经形成的淀粉样斑块。另外，由于BACE的同源蛋白BACE2在抑制剂的选择上与BACE非常类似，而BACE2可能在心血管系统中发挥一定的作用，仅部分抑制就可能致病。由此可见，通过识别、分离、纯化分泌酶，选择性抑制β分泌酶的活性，可能减少Aβ的产量，从而预防及改善AD症状这将是重要的研究方向。
【参考文献】
1 Selkoe D. The molecular pathology of Alzheimer′s disease〔J〕. Neuron, 1991; 6(4):48798.
2 Vassar R. The betasecretase, BACE:a prime drug target for Alzheimer′s disease〔J〕. J Mol Neurosci, 2001;17(2): 15770.
3 Lee JM, Bo JH, Chung IS,et al.Expression and characterization of recombinant betasecretase from Trichoplusia ni BTI Tn5B14 cells transformed with cDNAs encoding human beta1,4galactosyltransferase and Gal beta1,4GlcNAc alpha 2,6sialytransferase〔J〕. Protein Expr Purif,2005;44(2):8793.
4 William DM, Debra Y, Luisa O,et al.Characterization of recombinant, soluble βSecretase from an insect cell expression system〔J〕. Mol Pharmacol, 2001;59(3):61926.
5 Vassar R, Bennett BD, BabuKhan S,et al.Betasecretase cleavage of Alzheimer′s amyloid precursor protein by the transmembrane aspartic protease BACE〔J〕. Science, 1999; 286(5440): 73541.
6 Citron M. Emerging Alzheimer′s disease therapies: inhibition of betasecretase〔J〕. Neurobiol Aging，2002; 23 (6): 101722.
7 Cirton M.Secretases as targets for the treatment of Alzheimer′s disease〔J〕. Mol Med Today，2000; 6 (10): 3927.
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