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大孔吸附树脂纯化当药中獐牙菜苦苷的研究
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【西医学免费论文下载】作者:周大成,孟贺,李荣生,黄文哲,秦文杰,叶祖光【摘要】 目的 确定纯化当药中獐牙菜苦苷的大孔吸附树脂的类型及工艺条件。方法 以当药为原料,以当药中獐牙菜苦苷为指标,考察8种不同类型的大孔吸附树脂的纯化效果。结果 HPD-100型大孔吸附树脂对獐牙菜苦苷的纯化效果较好,其动态饱和吸附量为70.48 mg/g,依次用蒸馏水2 BV、30%乙醇4 BV洗脱,收集30%乙醇洗脱液,喷雾干燥,干粉样品中獐牙菜苦苷的含量为52.29%。结论 HPD-100型大孔吸附树脂对獐牙菜苦苷纯化效果较好,适合于当药中环烯醚萜类成分獐牙菜苦苷的富集纯化,可用于生产。 【关键词】 当药;环烯醚萜;獐牙菜苦苷;大孔吸附树脂;HPD-100 Abstract:Objective To explore the suitable type of macroporous adsorbent resin to purity swertiaman from Swertia pesudochinensis Hara., and determine the parameters and conditions for its purification procedures. Method Purification effect of 8 types of macroporous resins used to purify the Swertia pesudochinensis Hara. were inspected, with the content of swertiaman as index. Result HPD-100 type resin showed better effect than others, it had optimum adsorption and elution parameters with its dynamic saturated adsorption ratio was 70.48 mg/g. After eluted with 2 BV of distilled water, 4 BV 30% ethanol and collected, the content of swertiaman in the spray dried powder was 52.29%. Conclusion HPD-100 types macroporous resin showed a better comprehensive adsorption property and can be used to enrich and purify the swertiaman included active fraction of iridoid glycosides for industrialization. Key words:Swertia pesudochinensis Hara.;iridoid glycosides;swertiaman;macroporous adsorbent resin;HPD-100 当药为龙胆科獐牙菜属植物瘤毛獐牙菜(Swertia pesudochinensis Hara.)的全草,又名紫花当药、地格达、比拉山特-地格达(内蒙古),俗称“肝炎草”,为治疗肝炎的传统药物。《内蒙古中草药》载其治疗消化不良、胃炎、黄疸、火眼、牙痛、口疮;1977年版《中华人民共和国药典》(一部)收载用于传染性肝炎,急、慢性细菌性痢疾,食欲不振;《中华药海》上记其主治黄疸型肝炎,急、慢性细菌性痢疾,腹痛,消化不良等。 目前,尚未见对当药中的环烯醚萜类有效成分富集纯化研究的相关报道。大孔吸附树脂具有选择性吸附的性质,因其吸附量大、解析快、再生容易、使用周期长、成本低等优点,现已广泛应用于中草药的分离纯化[1]。为进一步开发利用当药药用资源,本试验以当药中环烯醚萜类代表性成分獐牙菜苦苷为指标成分,应用大孔吸附树脂层析技术,对其富集纯化工艺进行了研究,确定了适宜的大孔吸附树脂型号和具体的工艺参数。 1 仪器与试药 Agilent1100型高效液相色谱仪,DAD检测器;十万分之一天平(瑞士梅特勒TOLEDO AB135-S);Büchi旋转蒸发器(瑞士 步奇仪器厂)。 当药药材购于承德市药材公司,经中药复方新药开发国家工程研究中心黄文哲研究员鉴定为瘤毛獐牙菜Swertia pseudochinensis Hara.。獐牙菜苦苷对照品自制(含量为98.3%);HPD-100、HPD-300、HPD-400、HPD-600型大孔吸附树脂购于沧州宝恩化工有限公司,AB-8、D4020、D3520、NKA-9型大孔吸附树脂购于南开大学化工厂。乙腈为色谱纯(美国Sigma公司),其他试剂均为分析纯,水为超纯水。 2 方法与结果 2.1 獐牙菜苦苷的含量测定 2.1.1 系统适应性试验 色谱柱为ZORBAX SB-C18,流速1.0 mL/min,柱温25 ℃,检测波长238 nm。流动相为乙腈-水(10∶90)[2]。 2.1.2 上样溶液的制备 取当药药材1 kg,切段2~5 cm,加水提取3次,每次1 h,第1次12倍量,第2次和第3次10倍量,合并滤液。减压浓缩至体积与药材量比为4∶1,离心15 min,即得。 2.1.3 线性关系考察 精密称取獐牙菜苦苷对照品18.24 mg,置10 mL量瓶中,加水稀释至刻度,摇匀。精密吸取0.1、0.2、0.4、0.8、1.2、1.4 mL,分别稀释至5 mL,在上述色谱条件下进样检测。以浓度为横坐标,峰面积为纵坐标,绘制回归曲线,得回归方程:Y=28.01X+33.27,r2=0.999 9,獐牙菜苦苷在36.48~510.72 μg/mL呈良好线性。 2.1.4 加样回收率试验 取已知含量的终产品6份,每份0.1 g,精密称定,分别按照药材含量的80%、100%、120%加入对照品液,按照“2.1.1”项下方法,依法测定,平均回收率为98.92%, RSD=1.86%。 2.2 树脂型号的筛选 根据獐牙菜苦苷的理化性质,结合大孔吸附树脂的性能参数,选择8种树脂采用静态吸附试验进行初步筛选试验。 2.2.1 比吸附量的测定 精密称取已预处理的树脂,置于100 mL具塞三角瓶中,加入上样溶液,25 ℃振荡12 h,而后静置12 h。待吸附饱和后过滤,测定剩余溶液中獐牙菜苦苷的含量,计算大孔吸附树脂的比吸附量[比吸附量=(吸附前药液的质量浓度-吸附后药液的质量浓度)×体积/树脂重量]。结果HPD-100和HPD-300型大孔吸附树脂的比吸附量较好,见表1。表1 8种大孔吸附树脂相关参数及吸附量(略) 2.2.2 解析率考察 将静态吸附后的树脂滤出,吸干表面的水分,加入70%乙醇,25 ℃振荡12 h,而后静置12 h,待充分解析后检测解析液中獐牙菜苦苷的含量,计算洗脱量和解析率[解析率(%)=(吸附量-洗脱量)×100%]。结果HPD-100型大孔吸附树脂的解析率为98.27%,明显优于其他型号树脂。故选择HPD-100型大孔吸附树脂分离纯化当药中的獐牙菜苦苷。 2.3 吸附分离参数考察 2.3.1 树脂最佳吸附量考察 取上样液约200 mL,加于HPD-100型大孔吸附树脂床上,流速为1 BV/h。分段收集洗脱液,每段5 mL,共收集35份。以收集份数为横坐标,每份洗脱液的质量浓度为纵坐标,绘制吸附泄漏曲线,见图1。结果可见,从第20份洗脱液开始獐牙菜苦苷开始有泄漏,为确保獐牙菜苦苷完全不泄漏,故确定树脂可吸附獐牙菜苦苷的量为第1~19份上样液中獐牙菜苦苷的总量,折合成原药材量23.75 g。 2.3.2 洗脱液乙醇浓度考察 将已吸附好的HPD-100型大孔吸附树脂,先用水将树脂床中保留的上样溶液替换完毕,再依次用10%、30%、50%、70%、95%乙醇溶液各250 mL洗脱,体积流量1 BV/h,分段收集洗脱液,每份20 mL。以收集份数为横坐标,每份洗脱液的质量浓度为纵坐标,绘制洗脱曲线,见图2。结果可见,10%和30%乙醇洗脱液均能够将獐牙菜苦苷洗脱下来,但10%乙醇溶液洗脱能力不强,不能将獐牙菜苦苷洗脱完全,而30%乙醇溶液则能将獐牙菜苦苷迅速解析,且用量少,故选择30%乙醇溶液为洗脱溶媒。 2.3.3 水洗除杂用量考察 将吸附好的HPD-100型大孔吸附树脂先用水洗去除杂质,分段收集洗脱液,每1倍柱体积的洗脱液分4份收集,检测獐牙菜苦苷的含量,当洗脱液中检测到獐牙菜苦苷时停止洗脱。结果水洗至第10份即检测出獐牙菜苦苷,此时洗脱液几乎无色。故选择除杂水洗量为相当于2倍树脂床柱体积。 2.3.4 洗脱液最佳流速考察 取吸附好的HPD-100型大孔吸附树脂3份,用30%乙醇溶液洗脱,流速分别为0.5、1.0、2 BV/h,至洗脱液检测不含獐牙菜苦苷为止。结果所用洗脱液的量分别为5.1、4.5、4.2 BV。故结合生产物质和时间成本考虑,选择洗脱液流速为2 BV/h。 2.3.5 上样液浓度的影响 称取已处理好的HPD-100型大孔吸附树脂3份,分别用相同原药材量但浓缩后体积与药材重量比为6∶1、4∶1、2∶1的提取液上样,用水2 BV按照拟定的参数洗脱,检测洗脱液中獐牙菜苦苷的含量。结果除上样体积与原药材量比为6∶1的有泄漏外,其余2份均未见泄漏。综合考虑,选择上样液浓度为将提取液体积浓缩至与原药材量比为4∶1。 2.3.6 径高比的影响 称取已预处理好的HPD-100型大孔吸附树脂3份,按径高比1∶5、1∶6、1∶7上样,收集洗脱液,每1 BV分4份收集,检测每份洗脱液中是否含有獐牙菜苦苷的含量。结果3种径高比树脂柱的洗脱液开始检出獐牙菜苦苷的份数分别是第10、11、13份,径高比对实验的影响不大,结合生产实际,确定径高比为1∶5。 2.4 验证试验 按上述试验拟定工艺参数进行3批验证试验,结果见表2。表2 验证试验结果(略) 3 讨论 本试验表明,HPD-100型大孔吸附树脂对当药中环烯醚萜类成分獐牙菜苦苷具有很好的纯化效果,喷雾干燥所得粉末中獐牙菜苦苷的含量为52.29%。 另外,笔者还研究并制定了当药中环烯醚萜类成分的含量测定方法,检测该粉末中环烯醚萜类成分的含量为56.17%;并且经3批中试研究证明,拟定的工艺科学合理、稳定可行,适合于当药中环烯醚萜类成分獐牙菜苦苷的富集纯化,能够应用于当药有效部位的生产。 【参考文献】 [1] 周 剑,丁玉峰.大孔吸附树脂分离中草药有效成分的应用[J].中国医院药学杂志,2006,26(1):69-70. [2] 黄文哲,许春晖,周大成,等.RP-HPLC测定当药中环烯醚萜和三萜类成分含量[J].中国中药杂志,2007,32(23):2494-2496.
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