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纳米肿瘤疫苗的制备工艺的优化及特性鉴定

【中药学论文范文】【摘要】 目的: 制备无明显毒性、 高效的恶性肿瘤基因工程纳米疫苗。方法: 纯化融合蛋白MH, 薄膜分散-超声法制备包裹MH的纳米脂质体肿瘤疫苗NL(MH), 并评价其粒径、 包裹率及稳定性; 观察NL(MH)免疫组小鼠的急性毒性反应, 及重要脏器的病理学改变。结果: 成功制备出粒径为(80±250) nm的纳米脂质体, 其药物包裹率为30%, 于4℃放置6个月后或3 000 r/min 10 min离心后无分层, 证明其稳定性良好; 与PBS对照组相比, 免疫组小鼠未见明显毒性反应。结论: 该恶性肿瘤基因工程纳米疫苗具有良好的理化性质, 未见毒性反应。
【关键词】 肿瘤特异性抗原 脂质体 树突状细胞 肿瘤疫苗
肿瘤疫苗能诱导特异性的抗肿瘤免疫反应, 在肿瘤防治上已经显示出一定的效果, 被认为是最具前景的肿瘤治疗方法。本实验室运用MAGE3/Hsp70的融合蛋白免疫小鼠, 结果显示融合蛋白诱导机体产生高效的MAGE3特异性CTL, 对表达MAGE3的B16细胞有很好的杀伤效果[1]
。为了使该融合蛋白能更好地被机体摄取且更好地靶向肿瘤组织, 更有效地激活机体产生针对MAGE3的特异性CTL, 对表达MAGE3的肿瘤细胞具有更强的杀伤作用, 本部分实验中采用纳米脂质体为载体, 包裹MAGE3/Hsp70的融合蛋白(MH)制备恶性肿瘤基因工程纳米疫苗。
1 材料和方法
1.1 材料
分光光度计(UV3000型)为日本岛津公司产品; 透射电子显微镜(JEM2000 EX型)为日立公司产品; 集热式恒温加热磁力搅拌器(DF101B型)为巩义市予华仪器有限责任公司产品; 20 kHz/500 watt超声粉碎仪为美国ColeParmer公司产品; RPMIl640培养基购自
美国Gibco公司; 蛋黄卵磷脂和胆固醇为德国Merck公司产品; 其他试剂均为进口超纯级或国产分析纯级; pET28α(+)MAGE3/Hsp70质粒由本实验室研制。
1.2 方法
1.2.1 MAGE3/Hsp70融合蛋白的纯化与鉴定
MAGE3/Hsp70融合蛋白的纯化见文献[1]。采用Western blot法对MAGE3/Hsp70融合蛋白进行鉴定, 即取10 μg MAGE3/Hsp70的融合蛋白, 采用20 μL 20 mol/L PBS重悬细胞, 加入20 μL 2×Loading Buffer, 进行SDSPAGE。采用80 V, 60 min转移PVDF膜, 50 g/L脱脂乳TTBS室温下封闭PVDF膜60 min, 用TTBS 1∶500稀释MAGE3抗血清, 从封闭液中取出膜, 放入抗血
清中, 37℃ 60 min。TTBS洗膜3次每次10 min, 采用TTBS缓冲液1∶5 000稀释HRP标记的生物素化二抗, 37℃ 60 min, TTBS洗膜, DAB显色。
1.2.2 纳米脂质体的制备及工艺优化
采用薄膜分散超声法制备纳米疫苗, 选用4因素、 3水平正交设计进行工艺优化见表1(4个因素分别为大豆卵磷脂和胆固醇摩尔比(A)、 脂和水体积比(B)、 超声时间(C)、 PBS的pH值(D), 以包封率为考察指标来筛选处方)。脂质体具体制备步骤如下:秤取处方量的大豆卵磷脂和胆固醇于100 mL烧瓶中, 加入氯仿1~2 mL, 置于65~70℃ 水浴中, 于旋转蒸发仪上旋转, 减压除去氯仿, 得到磷脂膜。另取溶有目的蛋白(1 g/L)的PBS( pH=7.5±0.5)20 mL 于小烧杯中, 同置于65~70℃ 水浴中, 保温待用。取预热的PBS, 加至含有磷脂膜的烧瓶中, 65~70℃水浴中搅拌水化10~20 min, 即成脂质体液。取出该液于烧杯中, 置于磁力搅拌器上, 室温下搅拌30~60 min。冰水浴条件下超声10~20 min, 即得脂质体胶体液。0.1 μm聚碳酸树脂纤维过滤3次, 整粒, 得粒径较均匀的脂质体。用0.22 μm的滤膜过滤除菌后, 于4℃保存。表1 各个因素不同配比的正交设计(略)
1.2.3 NL(MH)的性质鉴定
(1)形态观察: 将制成的NL(MH)500倍稀释于生理盐水中, 取100 μL滴于400目铜网上, 1 min后吸去上清, 10 g/L磷钨酸负染色1 min, 自然晾干后在透射电子显微镜下观察其形态。将采集的图象经计算机图象分析, 求得NL(MH)的平均粒径。(2)包裹率及稳定性测定: 采用SephedexG100凝胶层析法, 洗脱液为PBS, 流速为0.5 mL/min。取NL(MH)1.0 mL上柱, 收集游离峰即为游离
的MH。同时制备不同浓度的MH标准蛋白样品, Bradford法测定蛋白的含量, 计算出NL(MH)中游离MH的含量。将制备的NL(MH)置于4℃冰箱保存6个月后或3 000 r/min 10 min离心后, 电镜观察纳米脂质体形态, 明确其稳定性。包封率=(系统中的总药量 液体介质中未包封的药量)/系统中的总药量×100%。(3)纳米疫苗急性毒性: 实验取二级条件C57BL/6小鼠20只, 雌雄不拘, 随机分为2组, 每组10只。PBS对照组:腹腔注射PBS 1.0 mL/鼠; 纳米疫苗(NL(MH)组): 腹腔注射包封MH的最大浓度0.3 g/L的纳米疫苗, 1.0 mL/鼠, 观察实验鼠有无急性中毒表现, 并记录两周内死亡小鼠的只数。实验结束时处死动物、剖检(肉眼观察主要脏器的大小、 硬度、 有无胸腹腔积液等)、 取心脏、 肝脏、 脾脏、 肺脏、 肾脏, 用4 g/L的甲醛固定, 石蜡包埋, HE染色, 行病理组织学观察。
1.2.4 统计学处理
应用SPSS11.5统计软件进行数据分析, P<0.05表示有统计学意义, 计量数据结果均以x±s表示。组间差异性比较采用oneway ANOVA。
2 结果
2.1 MAGE3/Hsp70融合蛋白的纯化与鉴定
含有pET28α(+)MAGE3/Hsp70质粒的BL21(DE3), IPTG诱导后进行SPSPAGE, 表达相对分子质量(Mr)为8 700的蛋白。经NiNTA Resin分离纯化系统分离纯化后得到纯度约为90%的蛋白(图1); Western blot检测于Mr约8 700出现特异性条带(图2), 证明是MAGE3/Hsp70的融合蛋白。
2.2 工艺优化结果
各因素的影响规律为C>B>A>D, 最佳工艺条件为A2、 B2、 C2、 D2 。按优化配方一次批量制备出纳米疫苗以供后续实验使用。
2.3 NL(MH)的形态与粒径
按优化工艺制备出的NL(MH)为带乳光的半透明均质胶体。透射电子显微镜下观察发现纳米脂质体呈近似球形, 大小较均匀(图3)。将采集的图象经计算机图象分析, 求得NL(MH)的平均粒径为80±25 nm。
2.4 纳米脂质体的包裹率及稳定性实验
经计算, NL(MH)的包裹率为30%。于4℃放置6个月或3 000 r/min 10 min离心后, 外观依然为
均质胶体混悬液, 无分层和沉淀现象。电镜观察颗粒大小无变化。
2.5 急性毒性的观察
对照组和实验组小鼠给药后均无呼吸急促、 摇摆、 发抖、 弓背、 半瘫、 身体僵直等急性中毒症状, 两周内无实验鼠死亡。剖杀动物后, 经肉眼观察, 对照组组织和器官未见明显异常, 实验组除小鼠脾脏相对增大外, 其他器官未见明显异常。病理学检查各重要脏器亦无明显异常变化如图4。纳米疫苗测不出半数致死量(LD50), 最大耐受量在15 mg/kg 以上。
3 讨论
NL(MH)具有纳米级粒径, 常规脂质体入血后, 血液中的调理素(补体、免疫球蛋白等)易吸附在它表面促使单核细胞吞噬并清除[2]。纳米载药系统可望克服蛋白/肽疫苗诸多的限制因素而成为肽类/蛋白质和DNA药物载体的一个研究热点[3]。不仅如此, 纳米脂质体还具有缓释的作用, Fundaro等研究了携带阿霉素的纳米脂质体在大鼠体内的药代动力学, 研究发现, 给药后24 h血液内仍有阿霉素, 而常规给药法则难以检测到[4]。我们实验制备的纳米脂质体呈球形, 粒径为(80±25) nm, 且大小较均匀, 首先从粒径上保证了其具有纳米药物载体的特性。NL(MH)具有无明显毒性特点:初步毒性实验结果表明: NL(MH)免疫小鼠10只全部健康存活, 对小鼠的一般情况无不良影响。纳米疫苗测不出半数致死量(LD50), 最大耐受量在15 mg/kg (以脂质体包裹的MAGE3/Hsp70融合蛋白的量计算)以上。剖检后NL(MH)组除脾脏变大, 其他脏器系数以及重要器官病理检查结果与PBS对照组之间均无明显差异。提示本疫苗无明显的毒副作用, 并且能够明显增大免疫器官指数。免疫器官指数的增加可增强荷瘤小鼠的免疫功能, 调动机体的防御系统起到遏制肿瘤生长和转移的作用, 这是细胞毒类药物所不具备的优点。我们实验制备NL(MH)选用的载体材料为大豆卵磷脂和胆固醇, 这些原料无毒, 生物相容性好, 可以通过体内代谢途径分解, 保证了制备的纳米药物载体具有无明显毒性的性质。NL(MH)具有良好的稳定性, 实验制备的纳米脂质体在4℃条件下储存6个月或3 000 r/min离心10 min后, 外观形态及理化指标都无明显改变。这一特性使纳米脂质体便于运输和保存, 将有利促进脂质体走向临床运用。
实验中制备的纳米脂质体的包裹率和文献报道的相差不大[5, 6], 后续实验也证明该疫苗具有很好的疗效, 但是距理想药物载体还有一段距离。因为蛋白、 多肽和DNA分子质量大, 不容易得到高浓度溶液, 在脂质体制备过程中, 所以不易得到高包封率。还需深入研究, 采取一定方法进一步提高蛋白药物的包裹率, 如改良制备工艺, 或者交联基团增加融合蛋白的脂溶性。

【参考文献】
[1]Ma JH, Sui YF, Ye J, et al. Heat shock protein 70/MAGE3 fusion protein vaccine can enhance cellular and humoral immune responses to MAGE3 in vivo[J]. Cancer Immunol immunother, 2005, 54 (9): 907-914.
[2]董兰凤, 吕占军, 刘京生. 肿瘤的靶向治疗不同途径的研究进展[J]. 细胞与分子免疫学杂志, 2003, 19(6): 623-625.
[3]Moghimi SM, Hunter AC, Murray JC. Longcirculating and targetspecific nanoparticles: theory to practice[J]. Pharmacol Rev, 2001, 53(2): 283-318.
[4]Fundaro A, Cavalli R, Bargoni A, et al. Nonstealth and stealth solid lipid nanoparticles (SLN) carrying doxorubicin: pharmacokinetics and tissue distribution after i.v. administration to rats[J]. Pharmacol Res, 2000, 42(4): 337-343.
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[6]石丽萍, 王录焕, 李英丽, 等. 不同方法制备125IIL8脂质体包封率的比较[J]. 标记免疫分析与临床, 2001, 8(3): 158-160.·论著·

 
 
 
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