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RKHog1基因敲除对红冬孢酵母YM25235低温生长适应性的影响
 
     论文目录
 
摘要第6-9页
Abstract第9-12页
第一章 绪论第17-29页
    1.1 微生物对多种环境胁迫的适应机制第17-22页
        1.1.1 微生物对高盐及渗透压胁迫的主要适应机制第17-20页
        1.1.2 微生物对低温胁迫的主要适应机制第20-21页
        1.1.3 微生物对氧化胁迫的主要适应机制第21-22页
    1.2 蛋白磷酸化激酶信号途径第22-24页
        1.2.1 MAPK信号通路第22页
        1.2.2 酵母中的MAPK信号通路第22页
        1.2.3 Hog1-MAPK信号通路第22-24页
    1.3 基因敲除系统简介第24页
    1.4 酵母遗传转化体系第24-26页
        1.4.1 LiAc遗传转化体系第24-25页
        1.4.2 根癌农杆菌介导的遗传转化体系第25页
        1.4.3 电击转化法第25-26页
    1.5 选题依据和技术路线第26-29页
        1.5.1 选题依据第26页
        1.5.2 研究背景及意义第26-28页
        1.5.3 技术路线第28-29页
第二章 红冬孢酵母YM25235 菌株的RKHog1 基因敲除第29-45页
    2.1 材料第29-30页
        2.1.1 菌株与质粒第29页
        2.1.2 试剂、试剂盒和培养基第29-30页
        2.1.3 引物合成和测序第30页
    2.2 方法第30-40页
        2.2.1 YM25235 菌株RKHog1 基因组同源臂的PCR扩增第30-33页
            2.2.1.1 YM25235 菌株基因组DNA的提取第30-31页
            2.2.1.2 RKHog1 基因组序列同源臂的扩增第31页
            2.2.1.3 RKHog1-A和 RKHog1-B两个扩增片段回收第31-32页
            2.2.1.4 RKHog1-A和 RKHog1-B两个回收片段测序验证第32-33页
        2.2.2 RKHog1 基因敲除载体的构建第33-37页
            2.2.2.1 RKHog1 基因同源臂的扩增第33页
            2.2.2.2 RKHog1-A和 RKHog1-B两个基因片段的回收纯化第33页
            2.2.2.3 质粒pRH2034 的提取第33页
            2.2.2.4 RKHog1-A片段与质粒pRH2034 的连接与鉴定第33-35页
            2.2.2.5 RKHog1-B片段与重组质粒pRHRKHog1(A)的连接与鉴定第35-37页
        2.2.3 RKHog1 基因敲除YM25235 突变株的筛选第37-40页
            2.2.3.1 RKHog1 基因敲除片段的扩增第37页
            2.2.3.2 RKHog1 基因敲除片段的回收纯化第37页
            2.2.3.3 RKHog1 基因敲除片段转化红冬孢酵母YM25235 菌株第37-38页
            2.2.3.4 RKHog1 基因敲除突变株的筛选验证第38-40页
    2.3 结果与分析第40-43页
        2.3.1 RKHog1 基因同源臂的扩增第40-41页
        2.3.2 RKHog1 基因敲除载体的构建第41-42页
        2.3.3 RKHog1 基因敲除突变株的筛选第42-43页
    2.4 讨论第43-45页
第三章 RKHog1 基因敲除对YM25235 菌株盐胁迫、渗透压和低温生长的影响第45-91页
    3.1 材料第45-47页
        3.1.1 菌株与质粒第45页
        3.1.2 试剂和培养基第45-46页
        3.1.3 引物合成和测序第46-47页
    3.2 方法第47-63页
        3.2.1 重组质粒pRHG418 的构建第47-49页
            3.2.1.1 G418 基因的扩增第47-48页
            3.2.1.2 G418 基因片段的回收纯化第48页
            3.2.1.3 G418 基因片段与质粒pRH2034 的连接与重组质粒鉴定第48-49页
        3.2.2 RKHog1 基因回补载体p RGRKHog1 的构建第49-51页
            3.2.2.1 RKHog1 基因的扩增第49-50页
            3.2.2.2 RKHog1 基因片段的回收纯化第50页
            3.2.2.3 RKHog1 基因与质粒pRHG418 的连接与鉴定第50-51页
        3.2.3 YM25235 菌株G418 最低抑制浓度分析第51-52页
        3.2.4 RKHog1 基因回补YM25235RKHog1Δ突变菌株的构建第52-53页
            3.2.4.1 重组质粒p RGRKHog1 转化YM25235RKHog1Δ突变菌株第52页
            3.2.4.2 RKHog1 基因回补的YM25235RKHog1Δ突变菌株的筛选第52-53页
        3.2.5 RKHog1 基因敲除对YM25235 菌株盐胁迫及高渗透压胁迫耐受性的影响第53-54页
            3.2.5.1 RKHog1 基因敲除对YM25235 菌株NaCl胁迫耐受性的影响第53页
            3.2.5.2 RKHog1 基因敲除对YM25235 菌株高渗透压胁迫耐受性的影响第53-54页
            3.2.5.3 NaCl胁迫条件下RKHog1 基因敲除对YM25235 菌株甘油合成的影响第54页
            3.2.5.4 高渗透压胁迫条件下RKHog1 基因敲除对YM25235 菌株甘油合成的影响第54页
        3.2.6 RKHog1 基因敲除对YM25235 菌株低温生长适应性的影响第54页
            3.2.6.1 RKHog1 基因敲除对YM25235 菌株低温生长的影响第54页
            3.2.6.2 低温条件下RKHog1 基因敲除对YM25235 菌株甘油合成的影响第54页
        3.2.7 刚果红和SDS压力条件下RKHog1 基因敲除对YM25235 菌株生长的影响第54-55页
        3.2.8 RKHog1 基因敲除对YM25235 菌株生长的影响第55页
        3.2.9 低温条件下RKHog1 基因敲除对YM25235 菌株多不饱和脂肪酸合成的影响第55-58页
            3.2.9.1 脂肪酸提取样品的处理第55页
            3.2.9.2 脂肪酸的提取第55-56页
            3.2.9.3 脂肪酸气相色谱分析第56页
            3.2.9.4 mRNA表达水平分析样品的处理第56页
            3.2.9.5 总RNA的提取第56页
            3.2.9.6 总RNA反转录成cDNA第56-57页
            3.2.9.7 RKHog1 基因mRNA转录水平的分析第57页
            3.2.9.8 RKHog1 敲除对Δ12/15-脂肪酸脱氢酶基因RKD12的mRNA转录水平的影响第57-58页
            3.2.9.9 RKHog1 敲除对锌指转录因子RKMsn4 mRNA转录水平的影响第58页
            3.2.9.10 RKHog1 敲除对组氨酸激酶基因RKHisK2301 mRNA转录水平的影响第58页
            3.2.9.11 RKHog1 敲除对G1 期细胞周期蛋白基因RKCLN1 mRNA转录水平的影响第58页
        3.2.10 RKHog1蛋白与锌指转录因子RKMsn4相互作用分析第58-62页
            3.2.10.1 酵母双杂交表达载体 pGADRKHog1 和 pGBKRKMsn4 的构建第58-61页
            3.2.10.2 重组质粒 pGADRKHog1 和 pGBKRKMsn4 转化Y2H 酵母菌株第61-62页
            3.2.10.3 RKHog1蛋白与锌指转录因子RKMsn4 相互作用分析第62页
        3.2.11 低温条件下RKHog1基因敲除对YM25235菌株RKHog1 蛋白磷酸化水平的影响第62-63页
            3.2.11.1 红冬孢酵母 YM25235 总蛋白的提取第62页
            3.2.11.2 标准曲线的绘制及蛋白质浓度的测定第62页
            3.2.11.3 RKHog1 蛋白磷酸化水平第62-63页
    3.3 结果与分析第63-85页
        3.3.1 重组质粒pRHG418 的构建第63-64页
        3.3.2 RKHog1 回补突变载体p RGRKHog1 的构建第64-65页
        3.3.3 YM25235 菌株G418 最低抑制浓度分析第65-66页
        3.3.4 RKHog1 基因回补YM25235RKHog1Δ突变株的筛选第66页
        3.3.5 RKHog1 基因敲除对YM25235 菌株的盐胁迫和渗透压胁迫耐受性分析第66-71页
            3.3.5.1 RKHog1 基因敲除降低了YM25235 菌株NaCl胁迫的耐受性第66-67页
            3.3.5.2 RKHog1 基因敲除降低了YM25235 菌株渗透压胁迫的耐受性第67-68页
            3.3.5.3 NaCl胁迫条件下RKHog1 基因敲除对YM25235 菌株甘油合成的影响第68-69页
            3.3.5.4 渗透压胁迫条件下RKHog1 基因敲除对YM25235 菌株甘油合成的影响第69-71页
        3.3.6 RKHog1 基因敲除明显降低了YM25235 菌株的低温生长适应性第71-73页
            3.3.6.1 RKHog1 基因敲除降低了YM25235 菌株的低温生长适应性第71页
            3.3.6.2 低温条件下RKHog1 基因敲除对YM25235 菌株的甘油合成的影响..第71-73页
        3.3.7 刚果红和SDS压力条件下RKHog1 基因敲除抑制了YM25235 菌株的生长第73页
        3.3.8 RKHog1 基因敲除影响了YM25235 菌株的生长第73-74页
        3.3.9 低温条件下RKHog1 基因敲除对YM25235 菌株多不饱和脂肪酸合成的影响第74-81页
            3.3.9.1 低温条件下RKHog1 基因敲除对YM25235 菌株脂肪酸含量变化的影响第74-77页
            3.3.9.2 低温条件下RKHog1 基因m RNA转录水平分析第77页
            3.3.9.3 RKHog1 基因敲除对Δ12/15-脂肪酸脱氢酶基因RKD12的mRNA转录水平的影响第77-78页
            3.3.9.4 RKHog1 基因敲除对锌指转录因子RKMsn4 mRNA转录水平的影响..第78-79页
            3.2.9.5 RKHog1 基因敲除对组氨酸激酶基因RKHisK2301 mRNA转录水平的影响第79-81页
        3.3.10 RKHog1 基因敲除对G1 期细胞周期蛋白基因RKCLN1 mRNA转录水平的影响第81-82页
        3.3.11 低温条件下RKHog1 基因敲除对YM25235 菌株RKHog1 蛋白磷酸化水平的影响第82-84页
        3.3.12 低温条件下RKHog1 基因敲除对YM25235 菌株RKHog1蛋白磷酸化水平的影响第84-85页
    3.4 讨论第85-91页
第四章 RKHog1 基因敲除对YM25235 菌株类胡萝卜素合成的影响第91-100页
    4.1 材料第91-92页
        4.1.1 菌种第91页
        4.1.2 主要试剂和培养基第91页
        4.1.3 引物合成和测序第91-92页
    4.2 方法第92-94页
        4.2.1 RKHog1 基因敲除对YM25235 菌株类胡萝卜素合成的影响第92-93页
            4.2.1.1 类胡萝卜素提取样品的处理第92页
            4.2.1.2 类胡萝卜素的提取第92-93页
            4.2.1.3 用于mRNA转录水平分析样品的处理第93页
            4.2.1.4 总RNA的提取和反转录第93页
            4.2.1.5 类胡萝卜素合成相关基因的mRNA转录水平分析第93页
        4.2.2 RKHog1 基因敲除对YM25235 菌株油脂合成的影响第93-94页
            4.2.2.1 油脂提取样品的处理第93-94页
            4.2.2.2 油脂的提取第94页
    4.3 结果与分析第94-98页
        4.3.1 RKHog1 基因敲除对YM25235 菌株类胡萝卜素合成的影响第94-95页
        4.3.2 RKHog1 基因敲除对类胡萝卜素合成相关基因mRNA转录水平的影响第95-97页
        4.3.3 RKHog1 基因敲除对YM25235 菌株油脂合成的影响第97-98页
    4.4 讨论第98-100页
第五章 总结与展望第100-103页
致谢第103-104页
参考文献第104-117页
附录 A 攻读硕士学位期间发表的论文和专利第117-118页
附录 B 实验所用溶液的配方第118-119页
附录 C 实验所用仪器设备第119页

 
 
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