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当前位置:教育论文中心首页--博士论文--猪瘟病毒RNA依赖的RNA聚合酶起始基因组RNA复制的分子机制研究
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猪瘟病毒RNA依赖的RNA聚合酶起始基因组RNA复制的分子机制研究
 
     论文目录
 
中文摘要第1-6页
英文摘要第6-13页
第一章 正链RNA病毒起始RNA合成的分子机制第13-26页
   ·正链RNA病毒基因组RNA结构与复制的多样性第13-15页
   ·病毒复制酶或RNA依赖的RNA聚合酶第15-17页
   ·正链RNA病毒起始RNA合成的机制第17-21页
     ·引物依赖的RNA合成第17-20页
     ·引物非依赖从头RNA合成第20-21页
   ·病毒可以利用一种或两种机制起始RNA合成第21-22页
   ·反应条件对起始RNA合成机制的影响第22-23页
     ·金属离子第22页
     ·温度第22页
     ·模板与酶量第22页
     ·5’帽子结构第22-23页
   ·模板起始核苷酸(T+1)与起始三磷酸核苷酸(NTPi)第23-24页
   ·起始RNA合成复合体第24-25页
   ·问题与展望第25-26页
第二章 猪瘟病毒的分子生物学研究进展第26-36页
   ·概述第26-28页
   ·猪瘟病毒编码基因的研究进展第28-32页
     ·结构蛋白的研究第28-29页
     ·非结构蛋白研究第29-32页
   ·非编码区的研究进展第32-35页
     ·5’UTR第32-33页
     ·3’UTR第33-35页
   ·本研究的背景与目的第35-36页
第三章 猪瘟病毒RNA依赖的RNA聚合酶基因的克隆、表达与纯化第36-56页
   ·材料与方法第36-44页
     ·病毒、菌株、载体和试剂第36-37页
     ·血毒中总RNA提取第37页
     ·RT-PCR反应第37-38页
     ·PCR产物回收纯化并克隆到pGEM-T载体第38页
     ·原核表达载体的构建第38-40页
     ·定点突变第40-41页
     ·RNA依赖RNA聚合酶的诱导表达第41页
     ·SDS-PAGE和蛋白免疫印迹第41-42页
     ·RNA依赖RNA聚合酶的亲和纯化第42页
     ·蛋白浓度测定第42-43页
     ·多克隆抗体的制备第43页
     ·序列比较分析与蛋白三级结构预测第43-44页
   ·结果第44-53页
     ·RNA依赖的RNA聚合酶基因的扩增及其序列分析第44-47页
     ·原核表达载体的构建及酶切鉴定第47-49页
     ·RNA依赖的RNA聚合酶在大肠杆菌中的诱导表达第49-50页
     ·RNA依赖RNA聚合酶的亲和纯化与鉴定第50-52页
     ·纯化蛋白的浓度测定第52页
     ·CSFVRNA依赖的RNA聚合酶的三级结构预测第52-53页
   ·讨论第53-56页
第四章 猪瘟病毒RNA依赖的RNA聚合酶起始病毒正链和负链RNA合成的分子机制第56-82页
   ·材料与方法第56-62页
     ·实验材料与试剂第56-57页
     ·正链和负链DNA模板以及突变模板的PCR扩增第57-58页
     ·体外转录第58-59页
     ·RNA模板的变性PAGE纯化第59页
     ·3’-OH封闭的RNA模板制备第59页
     ·RNA探针的制备第59页
     ·银染第59-60页
     ·体外RdRp反应第60页
     ·RT-PCR第60页
     ·实时荧光定量PCR第60-61页
     ·Northern blot分析第61-62页
   ·结果第62-75页
     ·病毒正链和负链DNA模板的扩增与RNA模板的制备第62-63页
     ·荧光定量PCR标准曲线的制作第63-64页
     ·纯化蛋RNA依赖的RNA聚合酶活性的检测第64-65页
     ·CSFV RdRp起始正链和负链RNA合成的分子机制第65-71页
     ·Mg~(2+)和Mn~(2+)对起始RNA合成的影响第71-72页
     ·反应条件对从头RNA合成的影响第72-73页
     ·高浓度的NTP预孵育对起始RNA合成的影响第73-74页
     ·CSFV RdRp优先利用模板3’末端胞嘧啶作起始核苷酸(T_(+1))第74-75页
   ·讨论第75-82页
     ·NS5BΔ24仍然具有RNA依赖的RNA聚合酶活性第75-76页
     ·CSFV RdRp从头起始RNA合成的证据第76-77页
     ·CSFV RdRp能以模板转换的方式起始正链RNA合成第77-78页
     ·对RdRp末端转移酶活性以及不同研究结果的可能解释第78-81页
     ·RNA模板3’末端胞嘧啶对起始RNA合成的重要性第81-82页
第五章 猪瘟病毒RNA依赖的RNA聚合酶与病毒正链、负链RNA模板特异性结合及RdRp亚细胞定位的研究第82-95页
   ·材料与方法第82-86页
     ·菌株、载体、细胞和试剂第82-83页
     ·非标记RNA模板与DIG标记RNA模板的制备第83页
     ·蛋白质的复性及North-Western blot第83页
     ·模板竞争试验第83-84页
     ·CSFV全长和截短的RdRp真核表达载体的构建第84-86页
     ·细胞转染第86页
   ·结果第86-94页
     ·CSFV RdRp与病毒正链、负链RNA模板之间结合的研究第86-87页
     ·RdRp与病毒正链和负链模板的特异性结合第87-89页
     ·真核表达质粒的酶切或PCR鉴定第89-90页
     ·全长RdRp与截短的RdRp在细胞中的定位第90-92页
     ·C末端疏水氨基酸可能是膜锚定序列第92-94页
   ·讨论第94-95页
第六章 猪瘟病毒NS5A蛋白原核表达与亚细胞定位的研究第95-105页
   ·材料与方法第95-99页
     ·细菌、细胞、载体和试剂第95页
     ·NS5A基因的扩增及原核表达载体的构建第95-97页
     ·5A-GFP融合蛋白在大肠杆菌中的表达及SDS-PAGE第97-98页
     ·瞬时表达质粒的构建第98页
     ·重组质粒转染细胞第98-99页
   ·结果与讨论第99-105页
     ·NS5A基因的PCR扩增与序列分析第99-101页
     ·pGEX-5A和pET-5A原核表达载体的构建与鉴定第101页
     ·NS5A蛋白在大肠杆菌中的诱导表达第101-102页
     ·瞬时表达载体p5A-EGFP的酶切鉴定第102-103页
     ·5A-GFP融合蛋白在PK-15细胞中的定位第103-105页
研究总结第105-106页
参考文献第106-122页
附录第122-124页
在读期间发表的文章第124-125页
致谢第125页

 
 
论文编号BS992397,这篇论文共125
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