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补骨脂的化学及代谢成分的超高效液相色谱串联质谱法鉴定
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【西医学评职称论文】作者：李晶晶，鹿秀梅，李发美，熊志立【摘要】 目的应用超高效液相色谱串联质谱法（UPLC-MS/MS）鉴定补骨脂的化学成分及其在大鼠血浆中的代谢产物。方法采用ACQUITY UPLCTM BEH C18色谱柱，梯度洗脱，并与电喷雾质谱联用，获得一、二级质谱信息，通过与文献或对照品对照，确定补骨脂的化学及代谢成分。结果在补骨脂提取物中检测到22个化学成分，鉴别出了17个成分，在含药血浆中检测出10个入血成分，鉴定出7个成分，分别为补骨脂素、异补骨脂素、psoralenoside、isopsoralenoside、6-羧甲基-7-羟基香豆素、补骨脂素和异补骨脂素的单羟基硫酸酯结合物。结论含药血浆中的10个入血成分可能为补骨脂体内直接作用的药效成分。
【关键词】 超高效液相色谱串联质谱法； 补骨脂； 化学成分； 代谢产物
补骨脂是豆科植物补骨脂Psoralea corylifolia L.的干燥成熟果实，具有温肾助阳、纳气、止泻之功效，现代药理研究表明该药有抗骨质疏松、抗肿瘤、抗菌及抗病毒等活性。关于补骨脂的化学成分分析研究已有大量报道［1～4］，大多以体外分析为主。而任何药物（中药）都是通过与人体相互作用发挥疗效的，血中含有的成分才是中药的体内直接作用物质，因此，从体内成分的角度去研究中药发挥药效的物质基础更为科学。目前关于补骨脂体内成分研究只有一篇文献报道［5］，采用HPLC-UV法检测出补骨脂入血后有3个代谢成分，但未能对其进行定性鉴别分析。本文采用UPLC-MS/MS法，研究补骨脂化学成分及大鼠口服其提取物后的代谢产物，为探究补骨脂药效物质奠定了基础。
1 材料与仪器
1.1 动物健康Wistar大鼠，体质量 250～300 g，雄性，沈阳药科大学实验动物中心提供。动物许可证号SCXK-(军)2007-004。
1.2 仪器ACQUITY UltraPerformance LCTM 超高效液相色谱仪（美国Waters公司），Waters Quattromicro API 三重四极杆串联质谱仪，配备电喷雾离子源（美国Waters公司），MassLynx 4.1数据采集软件（美国Waters公司），AL-104型电子天平［梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司］，RE-5203型旋转蒸发仪(上海亚荣生化仪器厂)。
1.3 试剂与样品补骨脂素、异补骨脂素对照品（中国药品生物制品检定所，批号110739-200613，110738-200309）；补骨脂药材（购自重庆合川，经沈阳药科大学药用植物教研室路金才副教授鉴定为豆科植物补骨脂 Psoralea corylifolia L.的干燥果实）。乙腈（HPLC级，TEDIA公司），乙酸、乙酸铵（HPLC级，Dikma公司）；水（纯净水，杭州娃哈哈集团有限公司）；其余试剂为分析纯。
2 方法
2.1 体外供试品溶液制备取补骨脂药材粉末2 g，95%乙醇回流提取，定容，过 0.22 μm微孔滤膜，即得补骨脂供试品溶液；另取补骨脂素和异补骨脂素对照品适量，精密称定，加甲醇溶解，制成补骨脂素和异补骨脂素的混合对照品溶液。
2.2 空白及含药血浆样品的制备取补骨脂药材粉末适量，95%乙醇回流提取3次，滤过，合并滤液，减压回收至干，加0.5%CMC-Na制成 1 g·ml-1灌胃剂(按补骨脂药材量计算)；取Wistar大鼠，禁食12 h，自由饮水，按 10 g·kg-1体质量剂量，灌胃给予补骨脂提取物，给药4 h后，通过眼眶后静脉丛采血1 ml，置于涂有肝素钠的管中，13 000 r·min-1离心 10 min，取上清液 200 μl，加入乙腈 600 μl，涡流 60 s，13 000 r·min-1离心 15 min，吸取上清液 600 μl，N2流下吹干，残渣用乙腈∶水（10∶90）100 μl溶解，涡旋 30 s，13 000 r·min-1离心 5 min，取上清液备用。
2.3 色谱条件ACQUITY UPLCTM BEH C18柱(100 mm×2.1 mm，1.7 μm)，流速 0.25 ml·min-1，柱温 40 ℃，样品室温度 4 ℃，进样量 5 μl，流动相 10 mmol·L-1醋酸铵水溶液(pH 4.0)(A)-乙腈(B)，梯度洗脱，0～2 min，0%～10% B，2～11 min，10%～95%B。
2.4 质谱条件ESI离子源，正、负离子同时检测，全扫描(MS Scan)，扫描范围 100～1 000 amu，毛细管电压 3.0 kV（ESI+）、2.9 kV（ ESI-），锥孔电压 35 V（ESI+）、25 V（ESI-），源温度 110 ℃。
2.5 补骨脂提取物体内外样品分析取混合对照品溶液、补骨脂供试品溶液、空白及含药血浆样品在相同色谱质谱条件下进行测定，建立色谱图，比较分析进入血液的成分。通过比对保留时间(tR)和解析离子碎片质荷比 (m/z)，对色谱峰进行指认，确定补骨脂提取物中化学成分及吸收入血的原形成分和可能的代谢产物。
3 结果
3.1 补骨脂提取物化学成分分析混合对照品溶液、补骨脂供试品溶液总离子流色谱图见图1。正、负离子同时检测模式下，在补骨脂供试品溶液中共检测到22个成分，通过比对对照品及文献［1～4］中的一级和二级质谱数据、色谱保留顺序等，推测出17个化学成分，其中包括对羟基苯甲醛及4个香豆素类，11个黄酮类，1个酚萜类化合物。补骨脂提取物化学成分的保留时间和一、二级质谱数据见表1。表1 补骨脂提取物中化学成分鉴别（略）
3.2 补骨脂提取物入血成分分析空白血浆及大鼠口服补骨脂提取物后 4 h 含药血浆总离子流色谱图见图2。比较空白及含药血浆色谱图，利用提取离子方法，在含药血浆中共检测到10个入血成分（保留时间、一级和二级质谱数据见表2）。表2 补骨脂含药血浆中入血成分鉴别（略）
通过对比保留时间和一、二级质谱数据，在正离子模式下，确定有4个原形成分，分别为补骨脂素（色谱峰5）、异补骨脂素（色谱峰7）、psoralenoside和isopsoralenoside（色谱峰1和2）。在负离子模式下，检测到2个原形成分-psoralenoside和isopsoralenoside（色谱峰1和2），及6个代谢物（M1～M6）。对6个代谢产物进行LC-MS/MS分析，得到二级质谱碎片离子，可以进行结构分析。
代谢物M1 MS谱中显示m/z 219［M-H］-准分子离子峰，MS/MS谱中产生1个碎片离子m/z 175。将m/z 219的碎片离子m/z 175进行进一步质谱分析，得到碎片离子m/z 147，119，91。参考文献［6］中甲氧基补骨脂内酯在体内可代谢为6-羧甲基-7-羟基-8-甲氧基香豆素，提示M1可能为补骨脂素呋喃环开环所得的代谢物-6-羧甲基-7-羟基香豆素。结构式如图3，M1的提取离子色谱图见图4。
代谢物M2和M3 M2的MS谱中显示m/z 281［M-H］-离子峰，MS/MS谱中产生1个主要碎片离子m/z 201。由于母离子脱去80 Da是硫酸酯结合物的特征，提示M2为硫酸酯结合物。对m/z 281的碎片离子m/z 201进行MS/MS分析，得到碎片离子m/z 173，145，129，117；M3的MS及MS/MS谱图与M2基本一致。参考文献［7］中欧前胡素与异欧前胡素的裂解途径，提示碎片离子m/z 201可能是羰基化的补骨脂素和异补骨脂素，而m/z 281的化合物为补骨脂素和异补骨脂素单羟基化产物的硫酸酯结合物。
代谢物M4，M5和M6 M4和M5的MS谱中均显示m/z 205［M-H］-离子峰，MS/MS谱中产生碎片离子m/z 187，161，由于成对出现，断裂规律相似，提示二者为同分异构体。M6的MS谱中显示m/z 245［M-H］-离子峰，MS/MS谱中产生碎片离子m/z 201，173。由于血浆样品量有限，M4～M6的结构无法进行进一步确认。
4 讨论
在实验色谱质谱条件下，空白血浆中8.5 min后出现响应较强的内源性物质的色谱峰，对血浆样品色谱分析造成了一定干扰，所以采用提取离子方法，在含药血浆总离子流色谱图中提取补骨脂提取物中已知成分，但并未检测到除补骨脂素、异补骨脂素、psoralenoside和isopsoralenoside外的原形成分。在补骨脂含药血浆中检测到的10个入血成分即为直接作用于人体的成分，可能为补骨脂发挥药效的物质基础。
【参考文献】
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［7］孙明谦， 卢建秋， 张宏桂. 呋喃香豆素类化合物电喷雾质谱裂解途径［J］. 药物分析杂志， 2009， 29 (1) : 82.
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