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增强红花黄色素A抗血栓作用的生物转化机理研究
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【西药科研论文】作者：徐春，高陪，沈竞，苏建，杨琼木，孙启玲【摘要】 目的对地衣芽孢杆菌（C213）发酵红花黄色素A（SYA）增强抗血栓作用的转化机理进行研究。方法高效液相色谱（HPLC）对SYA发酵前后的物质变化进行检测，用聚酰胺和制备型高效液相色谱对新物质进行分离并初步鉴定其结构。抗血栓作用是通过大鼠尾部血栓实验、凝血酶原时间（PT）、部分凝血酶活时间(APPT)等药效实验测定。结果发酵后生成的新物质（命名为SYAX）的抗血栓作用较SYA显著增强；其紫外吸收峰为353.6 nm，红外图谱中没有苯环峰出现，质谱显示其分子量为543。结论SYA通过C213的发酵，其抗血栓作用得到明显提高；该过程中，SYA被转化为一种新的高效抗栓成分SYAX。
【关键词】 生物转化 红花黄色素A 地衣芽孢杆菌 抗血栓
Abstract:ObjectiveTo study the substance foundation of fermentation of Flos Carthami with Bacillus licheniformis to improve its anti-thrombosis effect. MethodsBacillus licheniformis C2-13 was isolated from the aqueous compartments of slaughterhouse and used for the fermentation of Flos Carthami. The study of tail thrombosis, prothrombin time (PT) and activated partial thrombplastin time (APTT) were performed to measure the anti-thrombosis effect. High performance liquid chromatography (HPLC) was used to detect the product of fermentation and polyamide resin and preparative HPLC were used to isolate the new substance - SYA-X. Then Ultraviolet (UV), Infrared (IR) and Mass Spectrometry (MS) were used to analyze SYA-X. ResultsThe study of anti-thrombosis indicated that the anti-thrombosis effect of Flos Carthami was significantly improved after fermentation. The HPLC analysis indicated the effective compound of Flos Carthami-safflor yellow A (SYA, tR = 32.64 min) disappeared and a new substance SYA-X （tR＝23.82 min） formed during the fermentation. SYA-X was isolated from the fermentation broth. The peak value of SYA-X of UV went to 353.6 nm, IR did not have phenyl (1604,1505 cm-1) or phenyl syntonic trans -Alkene (1624,927 cm-1） and molecular ion peak was 543. These indicated the phenolic hydroxyl group of SYA disappeared and an acetyl formed in SYA-X. ConclusionFlos Carthami was fermented by C2-13 and its anti-thrombosis effect was improved. During the fermentation, the effective compound of Flos Carthami-safflor yellow A (SYA) was transformed into a new effective substance for thrombosis.
Key words:Bio-transformation； Safflor yellow A, Bacillus licheniformis； Anti-thrombosis
血栓类疾病在全球范围内已成为主要的致死性疾病。红花Flos Carthami是一种传统的抗血栓药物，原名红蓝花，入药部分为其干燥花，近年来广泛用于多种淤血阻滞，血行不畅之证，还可用于治疗冠心病、心绞痛以及气滞血淤所致的血栓闭塞性脉管炎等［1］。现代医学研究证明其主要抗血栓药效物质为红花黄色素A［2］（Safflor yellow A,简称SYA），市场上已有一系列的相关药物销售。但SYA这类天然药物抗血栓效价较低，提高无副作用的天然药物SYA的药效已成为当今抗血栓药物研究的热点。
本课题前期研究是用一株产纤维蛋白溶解酶的菌株〔地衣芽孢杆菌（C2-13）〕与红花共发酵来提高SYA的抗栓作用。药效实验证明，红花经过C2-13的发酵，其抗血栓作用得到明显的提高［3］。同时高效液相色谱显示发酵过程中SYA发生结构变化，并生成一种新的物质SYA-X。本文主要对SYA在发酵过程中的转化机理进行了研究。
1 材料与方法
1.1 菌种地衣芽孢杆菌Bacillus licheniformis C2-13是本实验室保藏的菌种，其分离自成都、重庆等地的屠宰场采集的屠宰废水。经过革兰氏染色法和M.R反应、V.P反应［4］及16SRNA等方法进行鉴定，确定为一株地衣芽孢杆菌。采用纤维蛋白平板法进行酶活测定［5］，其酶活为1 187 U/ml。
1.2 药品实验使用的红花产自四川，成都中医药大学药用植物实验室对其进行了鉴定。发酵使用红花黄色素A粗品购买自云南瑞宝天然色素有限公司，红花黄色素A含量为85%。红花黄色素A的对照品购自中国药检所，其高效液相检测纯度为99%。实验使用的其它化学药品都为分析纯的。
1.3 SYA与C2-13的共发酵发酵培养基（M/V）：SYA1%，蔗糖1.5%，玉米粉1%，酵母膏0.5%，以及少量无机盐等。培养基的pH用NaOH调到7.0。摇瓶培养使用500 ml的三角瓶装,装液量为20%，接种量为3.5%，（37±2）℃、180 r/min摇床培养48 h。
1.4 SYA发酵转化物质的分离及鉴定由于转化底物SYA为一种查尔酮苷［6］，SYA转化之后的产物可能为一种查尔酮的苷类衍生物，因此采用了聚酰胺树脂对转化产物进行分离。将发酵液在4℃、10 000 r/min高速离心10 min，取上清液进行聚酰胺树脂分离。分离条件：采用聚酰胺柱，淋洗剂为丙酮：水=2∶1；洗脱速度v=1.5 ml/min；收集时间2.5～6 h。通过该条件分离纯化的SYA-X含量达到60%以上。
对分离纯化之后的未知物质通过制备型高效液相色谱收集纯度达到98%以上的样品用于结构测定。利用紫外光谱、红外光谱、质谱等手段对发酵转化后新生成的物质进行初步的结构鉴定。
1.5 SYA-X与SYA的药效对比实验用前面分离得到的SYA转化生成的物质进行了抗血栓实验，通过对胶叉菜胶引起小鼠尾部血栓的抑制，凝血酶原时间（PT）和部分凝血酶活时间（APTT）这3个参数测定抑制体内血栓形成药效的影响［7］。实验大鼠随机分为4个给药组，分别是：①正常大鼠对照组；②转化后物质组；③SYA对照组；④阳性对照组。各组的给药浓度按照实验要求保持一致。
2 结果
2.1 SYA经过C2-13发酵转化后成分的改变以前的研究表明红花经过C2-13发酵之后主要是其药效成分SYA发生了转化［8］，因此本实验用C2-13单独发酵转化SYA以研究其成分具体的改变。
对SYA在经过C2-13酵转化前后的HPLC图谱(图1～2)进行比较可以看出tR=32.66的SYA主要转化成为tR=23.83的一种物质（SYA-X）以及少量的tR=10.01等新物质,与红花发酵的结果相同（图3～4）。
实验结果表明，SYA-X极性比SYA高，分子中的共轭链降低。推断SYA-X可能是SYA分子中一个极性较小的基团发生了结构变化，同时使基团共轭体系降低，产生了一个极性相对较大的基团，从而增加了生成物的极性，又使共轭体系减少，这样便使SYA-X的分子极性增加，吸收峰向紫外移动。
2.2 SYA-X结构分析
2.2.1 紫外结果由图5和图6比较可以看出， SYA的紫外吸收峰是403 nm，与SYA紫外吸收的文献值一致［9］。在发酵转化之后，原SYA在403 nm处的吸收峰消失，而新生成的SYA-X最大紫外吸收峰出现在353.60 nm。可见，经过发酵转化后，SYA转化成为了一种紫外最大吸收为353.60 nm的新物质。根据紫外光谱的改变，推断SYA-X与SYA相比，其结构的改变是共轭体系的降低，即SYA-X可能是SYA分子中失去一个发色团而成。
2.2.2 红外结果SYA-X红外光谱：IRmaxkbsCm-1呈羟基（3 400 Cm-1，钝峰），糖基中C-O（1 124 Cm-1），甲基（2 926.42 Cm-1），羰基（1 640.99 Cm-1），这些红外特征峰在SYA红外谱中相应存在，这一事实表明SYA-X和SYA的基本构架是一致的。与SYA红外光谱［10］相比，SYA-X的红外谱中没有苯环结构（1 604，1505 Cm-1）或苯环共振反式双键（1 624，927 Cm-1）的吸收。从而可以判断SYA的分子中失去的发色团是其查尔酮结构中的酚基。
2.2.3 质谱结果发酵转化前SYA的分子量为594，发酵转化后SYA-X的分子离子峰为543，基峰分子量为525，推断为其糖基上缩合失去了一分子水而形成环状结构从而形成分子离子峰。因此SYA-X可能是SYA失去了一个酚基转化成为一个乙酰基而成。
2.3 SYA-X的抗血栓药效根据文献记载，红花中对血栓类疾病的药效主要源自其药效成分SYA，而实验证明经过C2-13发酵转化之后红花中发生改变的主要物质也是SYA，故红花发酵液药效的提高可能与SYA的转化有关。将SYA经过C2-13发酵转化后生成的SYA-X经过分离纯化之后，进行小鼠尾部血栓及凝血、纤溶指标的检测以确定其药效。结果见表1。表1 发酵转化红花对小鼠血栓的影响（略）
实验证明（见表1），经过发酵转化之后的SYA-X与空白组和SYA对照组相比，均能显著地降低小鼠尾部血栓百分数，并能延长凝血酶原时间（PT）和部分凝血酶活时间（APTT）。3组实验都能够显著降低小鼠尾部血栓百分数，缩短小鼠尾部血栓长度，延长凝血酶原时间（PT）和部分凝血酶活时间（APTT）,说明SYA转化前后具有抗血栓作用；转化后各方面的参数优于发酵前，甚至优于与阳性对照,表明SYA转化生成SYA-X具有更好的抗血栓药效。SYA-X，SYA结构式见图7～8。
3 结论
Takahashi等研究表明红花黄色素A是红花中抗血栓的有效成分。通过高效液相检测发酵培养基发现SYA发酵后生成了一种新的物质（SYA-X）。我们对发酵液中SYA-X进行了分离、纯化，并通过紫外光谱、红外光谱和质谱等方法对其结构进行分析，其分子式为C23H29O15，结构式如图7所示。同时药效学实验证明SYA-X的抗血栓作用强于SYA或纤溶酶。
将红花黄色A结构（图8）与推断的SYA－X的结构相比较，红花黄色素A上的一个酚羟基发生开环生成乙酰基导致SYA－X的极性增强。微生物对苯环的降解开环有两个代谢途径：β- Ketoadipate pathway 和 α-Ketoacid pathway［11］。根据这两种苯环开环途径可能的代谢产物与质谱结果相比较，SYA按照α-Ketoacid途径代谢可能的终产物的分子量为543，与SYA－X的分子量相吻合；SYA根据β- Ketoadipate途径的代谢产物的分子量应为602，发酵后的发酵液中未检出该物质。同时β- Ketoadipate途径应有的琥珀酰的羧基结构在IR图谱中也未有发现。因此推断SYA-X即为SYA按照间位开环途径转化之后形成的新物质，其分子量为543。
【参考文献】
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