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春柴胡中槲皮素30葡萄糖醛酸苷的单体制备与含量测定研究
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【护理医学论文】作者：赵明，王博，欧阳臻，张磊，浦秀华，潘璐琳【摘要】 目的分离制备春柴胡中特征化学成分并建立含量测定方法。方法采用聚酰胺柱色谱，制备薄层色谱，Sephadex LH - 20柱色谱分离纯化，利用波谱技术(LC-MS，UV，1H-NMR)进行结构鉴定；采用高效液相色谱法分析，色谱柱 Kromasil C18（4.6 mm ×250 mm, 5 μm)，流动相甲醇- 0.5%醋酸（43∶57，V/V)，检测波长365 nm。结果从春柴胡正丁醇萃取部位分离得到一化合物，鉴定为槲皮素-3-O-葡萄糖醛酸苷；槲皮素-3-O-葡萄糖醛酸苷的线性范围为4.375～140 μg·ml-1，r= 0.999 8；平均回收率为98.43%，RSD为2.26% (n=6)。结论槲皮素-3-O-葡萄糖醛酸苷化合物系首次从该柴胡属植物中分离得到，建立的春柴胡中槲皮素-3-O-葡萄糖醛酸苷高效液相色谱含量测定方法，简便、准确可靠，可用于春柴胡药材的质量控制。
【关键词】 春柴胡； 化学成分； 槲皮素-3-O-葡萄糖醛酸苷； 高效液相
柴胡为常用的发散风热药，具有和解表里，疏肝解郁，升阳的功能，在我国已有二千多年的应用历史。《中国药典》2005年版收载的柴胡为伞形科植物柴胡Bupleurum chinense DC.或狭叶柴胡Bupleurum scorzonerifolium Willd.的干燥根［1］。江苏的大部分地区和安徽的东部习用春季采收的狭叶柴胡带根全草，俗称“春柴胡”，常替代药典柴胡入药［2～4］。国内外对柴胡化学成分的研究报道较多［5～9］，但对春柴胡的化学成分尚未见系统研究和报道，对春柴胡还没有全面可行的质量评价标准。为建立春柴胡药材资源的质量评价标准和临床安全用药提供依据，我们系统对其化学成分进行了研究，首次从春柴胡乙醇提取物的正丁醇部位分离、制得一春柴胡特征化合物，经鉴定为槲皮素-3-O-葡萄糖醛酸苷，并建立了春柴胡中特征成分槲皮素-3-O-葡萄糖醛酸苷高效液相含量测定方法，可用于春柴胡药材和以春柴胡为主药的复方制剂的质量控制。
1 仪器与材料
1.1 仪器与试药UV22102PCS 型紫外分光光度计（尤尼柯(上海)仪器有限公司）；SHB-Ⅲ循环水式多用真空泵（郑州长城科工贸有限公司）；HH-S数显恒温水浴锅。JASCO LC1500高效液相色谱系统（日本分光公司）； N2000色谱工作站（浙江大学信息智能研究所）；METTLER AE240分析天平（上海梅特勒-托利多仪器有限公司）；台式冷冻高速离心机TGLL-18K（江苏太仓华美生化仪器有限公司）BRUKER400型核磁共振仪。
甲醇为色谱纯（江苏汉邦科技有限公司），水为娃哈哈纯净水，其余试剂均为分析纯。
槲皮素-3-O-葡萄糖醛酸苷对照品(自行从春柴胡药材中分离、精制而得，经光谱鉴定结构，并利用面积归一化法进行纯度检查，纯度为99.5% ) 。
1.2 药材春柴胡药材采集于镇江句容地区，（见表1）。均由镇江市药品检验所张林松主任中药师鉴定，为春季采收的狭叶柴胡Bupleurum scorzonerifolium Willd.带根的全草，晒干备用。表1 药材来源（略）
2 方法与结果
2.1 春柴胡中槲皮素-3-O-葡萄糖醛酸苷分离制备及结构鉴定
2.1.1 提取分离取春柴胡200 g，加8倍量70%乙醇回流提取3次，1 h/次，合并提取液，滤过，滤液浓缩至稠膏，取稠膏加水200 ml溶解，依次用石油醚、醋酸乙酯、正丁醇分别萃取。获正丁醇部位1.1g，经聚酰胺柱色谱，以水-乙醇梯度洗脱，每流分收集约200 ml，取流分(4～20)合并，回收溶剂得混合物，取混合物用适量甲醇溶解，经制备薄层色谱分离，得化合物Ⅰ，Ⅱ。取Ⅰ经Sephadex LH - 20柱精制得一黄色化合物Ⅰ(33 mg)。
2.1.2 结构鉴定化合物Ⅰ 黄色粉末，UV（MeOH）nm: 355，258，210；ESI-MS m / z：479 ［M +H ］+ ，501 ［M +Na ］+，303 ［M +H-176 ］+，经酸水解检测到槲皮素苷元，1 HNMR (CD3OD，400 MHz)δ：δ：8.02 (1H, d, J=2.2Hz, H-2')，7.50 (1H，dd，J=8.9 and 2.2 Hz, 6'-H )，6.86(1H，d，J= 9.04 Hz，5'-H)，6.35 (1H，d，J= 1.48Hz，8-H)，6.17( 1H，d，J= 1.48 Hz，6-H)，5.32 ( 1H，d，J= 7.56 Hz，1″-H)，3.64 ( 1H，d，J= 9.52 Hz，5″-H)，3.48-3.60 ( 3H，m，2″，3″，4″-H) ；其理化常数和光谱学数据与文献［10］报道一致，故鉴定化合物Ⅰ为槲皮素-3-O-葡萄糖醛酸苷( quercetin-3-O-glucuronide)。
2.2 春柴胡中槲皮素-3-O-葡萄糖醛酸苷的含量测定
2.2.1 色谱条件色谱柱为Kromasil C18(4.6 mm×250 mm，5 μm) ，检测波长365 nm，柱温30℃，流速0.7 ml·min-1，流动相为甲醇- 0.5%醋酸（43∶57，V/V)，进样体积为20 μl，记录40 min。在上述色谱条件下，对照品和样品的色谱图见图1。
2.2.2 供试品溶液的制备取春柴胡药材粉末（过40目筛）1 g，精密称量，置100 ml锥形瓶中，精密加入50%乙醇50 ml，超声提取30 min，放冷，再称定重量，用50%乙醇补足重量，滤过，取续滤液经0.45 μm滤膜滤过即得。
2.2.3 对照品溶液的制备精密称取在50 ℃真空干燥至恒重的槲皮素-3-O -葡萄糖醛酸苷14.0 mg，置50 ml容量瓶中，加50%乙醇溶解并稀释至刻度摇匀，即得含量为0.280 mg·ml-1的对照品储备溶液。
2.2.4 线性关系考察分别精密吸取槲皮素-3-O-葡萄糖醛酸苷对照品储备溶液，用50%乙醇稀释成浓度分别为4.375，8.75，17.5，35，70和140 μg·ml- 1的系列对照品溶液，精密吸取上述对照品溶液20 μl，注入液相色谱仪，测定峰面积。以峰面积（Y）为纵坐标，浓度(μg·ml-1)为横坐标，绘制标准曲线，回归方程为：Y = 33 434 X -61 104，r =0.999 8，表明槲皮素-3-O-葡糖醛酸苷在4.375～140 μg·ml-1线性关系良好。
2.2.5 精密度实验
精密吸取槲皮素-3-O -葡萄糖醛酸苷对照品溶液(0.070 mg·ml-1 ) 20 μl，按上述色谱条件进样分析，连续6次，测定峰面积，其RSD为1.40% ，表明方法精密度良好。
2.2.6 稳定性实验精密吸取同一供试品溶液20 μl，按上述色谱条件，分别于0，2，4，8，12，24 h测定峰面积。结果表明，槲皮素-3-O-葡萄糖醛酸苷峰面积的RSD为2.10% ( n =6) ，说明供试品溶液在24 h内稳定。
2.2.7 重复性实验取同一春柴胡药材5份，按供试品溶液制备方法制备供试品溶液，分别精密吸取20 μl，按上述色谱条件进样测定峰面积，其RSD为2.17% ( n = 5) ，表明方法重复性良好。
2.2.8 加样回收率精密称取已知含量的春柴胡药材样品(春柴胡5.14) 6份各0.5 g，分别精密加入对照品50%溶液适量，按供试品溶液的制备方法制备供试品溶液，按上述色谱条件进样测定，计算得槲皮素-3-O -葡萄糖醛酸苷平均回收率为98.43%，RSD为2.26% ( n=6) 。表2 加样回收率实验结果（略）
2.2.9 样品含量测定春柴胡样品含量测定见表3。表3 样品的测定结果（略
3 讨论
本论文采用柱层析和薄层制备联用的方法首次从春柴胡药材中发现并分离制得槲皮素-3-O-葡萄糖醛酸苷单体，经光谱鉴定结构，并利用面积归一化法纯度检查，纯度为99.5%。并首次建立了春柴胡中槲皮素-3-O -葡萄糖醛酸苷HPLC含量测定方法，该方法灵敏度高、操作简便。
对不同采收期及不同部位春柴胡中槲皮素-3-O-葡萄糖醛酸苷的含量进行了分析，结果表明，不同采收期春柴胡中槲皮素-3-O-葡萄糖醛酸苷的含量差别很大，其中以四月中旬含量最高，这与传统春柴胡药材最佳采收季节为四月至五月相吻合，不同部位春柴胡中叶的含量要明显高于茎和根。并且发现北柴胡与地上部分均没有槲皮素-3-O-葡萄糖醛酸苷，故该成分可作为春柴胡的特征性成分，本研究结果为春柴胡的质量评价提供依据。但春柴胡化学成分与药效之间的关系，还有待进一步研究。
【参考文献】
［1］中国药典委员会.中国药典(Ⅰ部)［S］.北京：人民卫生出版社，2005:198.
［2］中国医学科学院.中药志(1)［M］.北京:人民卫生出版社，1959: 366.
［3］徐国钧.常用中药材品种整理和质量研究(南方协作组，第三册)［M］.福州：福建科学技术出版社，1997:1.
［4］潘胜利，柏巧明，包雪声，等.中国药用柴胡原色图志［M］.上海：上海科学技术文献出版社，2002: 3.
［5］宋治中，贾忠建.兴安柴胡化学成分研究 (Ⅰ) ［J］.兰州大学学报（自然科学版），1992，28（3）：99.
［6］罗思齐，金惠芳.北柴胡茎叶的化学成分研究［J］.中国中药杂志，1988, 13( 1):36.
［7］王 宁，王金辉，李 铣.北柴胡地上部分化学成分的分离与鉴定［J］.沈阳药科大学学报，2005，22（5）：342.
［8］李鸿英，陆长根，李秀华.小柴胡黄酮的分离及结构鉴定［J］.植物学报（英文版），1985，11（1）：77.
［9］Tingting Zhang, Jinsong Zhou, Qiang Wang. Flavonoids from aerial part of Bupleurum chinense DC［J］ . Biochemical Systematic and Ecology，2007，35：801.
［10］JAE-HAK Moon,Tojiro Tsushida,Kazuhiko Nakahapa.Identification of quercetin 3-O-D-Glucuronide as an antioxidative metabolite in rat plasma after oral adminstration of quercetin［J］.Free radical biology﹠medicine,2001,30(11)：1274.
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