| 中文摘要 | 第9-10页 |
| Abstract | 第10页 |
| 1.引言 | 第11-35页 |
| 1.1 斑茅对甘蔗抗旱育种的意义 | 第11-12页 |
| 1.2 干旱对农作物生长的影响 | 第12-19页 |
| 1.2.1 干早胁迫对植物的伤害 | 第12-13页 |
| 1.2.1.1 植物生长受到抑制 | 第12-13页 |
| 1.2.1.2 消弱植物的光合作用 | 第13页 |
| 1.2.1.3 活性氧对植物的氧化伤害 | 第13页 |
| 1.2.2 植物耐旱性的生物学机理 | 第13-16页 |
| 1.2.2.1 通过调整气孔开闭来防止水分散失 | 第13页 |
| 1.2.2.2 渗透调节 | 第13-14页 |
| 1.2.2.3 抗氧化防御系统 | 第14-15页 |
| 1.2.2.4 脱落酸作用 | 第15页 |
| 1.2.2.5 Lea蛋白的保护作用 | 第15-16页 |
| 1.2.2.6 水通道蛋白在农作物抗旱机制中的作用 | 第16页 |
| 1.2.3 植物水分胁迫的分子响应 | 第16-19页 |
| 1.2.3.1 水分胁迫的信号感知 | 第17页 |
| 1.2.3.2 水分胁迫的信号传导 | 第17-18页 |
| 1.2.3.3 水分胁迫的基因表达 | 第18-19页 |
| 1.3 抗旱基因的分离克隆策略 | 第19-22页 |
| 1.3.1 基于基因的DNA序列分离基因的方法 | 第20页 |
| 1.3.2 基于基因功能的分离方法 | 第20-21页 |
| 1.3.3 从基因转录产物分离 | 第21页 |
| 1.3.4 基于基因翻译产物的方法 | 第21-22页 |
| 1.4 全长cDNA文库构建方法的研究进展 | 第22-33页 |
| 1.4.1 Oligo-Capping方法(Oligo-Capping Method) | 第22-24页 |
| 1.4.2 CAPture法(CAPture Method) | 第24-26页 |
| 1.4.3 SMART法(Switching Mechanism At5'end of RNA Transcript methodl | 第26-30页 |
| 1.4.4 CAP-Trapper法(CAP-Trapper Method) | 第30-32页 |
| 1.4.5 CAP-Jumping法 | 第32-33页 |
| 1.5 本研究的目的意义,研究内容和技术路线 | 第33-35页 |
| 2.材料和方法 | 第35-42页 |
| 2.1 实验材料 | 第35-37页 |
| 2.1.1 植物材料 | 第35页 |
| 2.1.2 主要仪器 | 第35页 |
| 2.1.3 主要试剂和试剂盒 | 第35页 |
| 2.1.4 所用质粒载体、引物、细菌 | 第35-37页 |
| 2.1.4.1 质粒载体 | 第35-36页 |
| 2.1.4.2 引物 | 第36-37页 |
| 2.1.4.3 所用细菌 | 第37页 |
| 2.2 实验方法 | 第37-42页 |
| 2.2.1 斑茅抗旱全长cDNA文库的构建 | 第37-39页 |
| 2.2.1.1 斑茅的干旱处理 | 第37-38页 |
| 2.2.1.2 总RNA的提取和mRNA的纯化 | 第38页 |
| 2.2.1.3 全长cDNA第一链的合成 | 第38页 |
| 2.2.1.4 全长cDNA第二链的合成 | 第38页 |
| 2.2.1.5 分段切取ds cDNA片段 | 第38页 |
| 2.2.1.6 与T-Vector连接和转化 | 第38页 |
| 2.2.1.7 文库滴定、重组率测定 | 第38-39页 |
| 2.2.1.8 cDNA文库质量鉴定 | 第39页 |
| 2.2.1.9 选取个别片段的菌落进行测序 | 第39页 |
| 2.2.2 渗透胁迫下HIR基因的荧光实时定量分析 | 第39-40页 |
| 2.2.2.1 斑茅叶片总RNA制备以及纯度、完整性鉴定 | 第39页 |
| 2.2.2.2 cDNA合成 | 第39页 |
| 2.2.2.3 FQ-PCR(两步法PCR扩增) | 第39-40页 |
| 2.2.3 构建载体 | 第40-41页 |
| 2.2.3.1 构建环境诱导型表达载体 | 第40页 |
| 2.2.3.2 构建RNAi载体 | 第40-41页 |
| 2.2.4 转化: | 第41-42页 |
| 2.2.4.1 将环境诱导型载体转入农杆菌 | 第41页 |
| 2.2.4.2 转化拟南芥 | 第41页 |
| 2.2.4.3 用草甘膦进行筛选 | 第41页 |
| 2.2.4.4 对阳性转化植株提取DNA做PCR验证 | 第41-42页 |
| 3.结果与分析 | 第42-53页 |
| 3.1 斑茅全长cDNA文库的构建 | 第42-44页 |
| 3.1.1 总RNA的制备 | 第42页 |
| 3.1.2 全长cDNA第一链的合成 | 第42-43页 |
| 3.1.3 全长cDNA第二链的合成 | 第43页 |
| 3.1.4 cDNA文库的构建和质量鉴定 | 第43-44页 |
| 3.1.5 全长文库部分克隆的测序分析 | 第44页 |
| 3.2 HIR全长基因的分析 | 第44-48页 |
| 3.2.1 基因的预测 | 第44-47页 |
| 3.2.2 荧光定量实时PCR分析 | 第47-48页 |
| 3.3 HIR基因功能的初步分析 | 第48-53页 |
| 3.3.1 环境诱导型载体构建 | 第48-50页 |
| 3.3.1.1 HIR基因的扩增 | 第48页 |
| 3.3.1.2 目的基因与环境诱导型载体pCRBI连接 | 第48-49页 |
| 3.3.1.3 连接产物转入农杆菌 | 第49-50页 |
| 3.3.2 转化 | 第50-51页 |
| 3.3.3 RNAi载体构建 | 第51-53页 |
| 3.3.3.1 正向片段的连入 | 第51页 |
| 3.3.3.2 反向片段的连入 | 第51-53页 |
| 4.讨论 | 第53-57页 |
| 4.1 RNA提取 | 第53页 |
| 4.2 双链cDNA合成 | 第53-54页 |
| 4.3 HIR基因在作物抗旱中的作用 | 第54-57页 |
| 5.结论与展望 | 第57-58页 |
| 参考文献 | 第58-63页 |
| 附录 | 第63-71页 |
| 附录1:文库测序结果举例 | 第63-68页 |
| 附录2:所用分子生物学实验方法 | 第68-70页 |
| 1.大肠杆菌感受态细胞的制备 | 第68页 |
| 2.大肠杆菌细胞的热激法转化 | 第68-69页 |
| 3.根癌农杆菌感受态细胞制备 | 第69页 |
| 4.农杆菌细胞的冻融法转化 | 第69页 |
| 5.CTAB提取拟南芥基因组DNA | 第69页 |
| 6.LB培养基 | 第69-70页 |
| 7.YEB培养基 | 第70页 |
| 附录3:缩写词 | 第70-71页 |
| 在学期间发表的论文 | 第71-72页 |
| 致谢 | 第72页 |
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