|
|
|
|
托拉塞米产品中起始原料残留量分析方法的研究
|
|
【西医学论文集】曹晓燕 姚 勃 万 琼 唐永丰[摘要] 目的：建立高效液相色谱法控制原料药托拉塞米中起始原料4-羟基吡啶与间甲苯胺的残留量的分析方法。方法：采用Agilent C18柱，以0.02 mol/L磷酸二氢钾溶液－甲醇(3∶2)为流动相，检测波长240 nm，流速为1.5 ml/min，柱温为室温。结果：两种物质4-羟基吡啶浓度为0.014~1.244 μg/ml，间甲苯胺浓度为0.081~1.317 μg/ml的溶液的峰面积与浓度成线性关系，相关系数r≥0.99；定量限和检测限试验中，信噪比符合规定，能够达到定量检测及检出的要求；各浓度下的4-羟基吡啶、间甲苯胺平均回收率均在90%～110%范围内，且9个回收率的RSD均小于5.0%。结论：该方法专属性好，精密度、准确度都符合要求，方法可靠，可用于原料药托拉塞米中起始原料4-羟基吡啶与间甲苯胺的残留量的控制。
[关键词] 托拉塞米；4-羟基吡啶；间甲苯胺；高效液相色谱
[Abstract] Objective：To establish a HPLC method to determine the content of the residual starting materials, 4-hydroxypyridine and m-tuloidine, in torasemide drug substance. Methods：The Agilent C18 column (15 cm×4.6 mm×5.0 μm) was used. The mobile phase was methanol-dibasic potassium phosphate(2∶3). The detection wavelength was at 240 nm. The flow rate was 1.5 ml/min. Results：The calibration curves were linear within the range of 0.014～1.244 μg/ml(r=0.999 8) for 4-hydroxypyridine and 0.081～1.317 μg/ml(r=0.999 8) for m-tuloidine, respectively. The average recoveries were 90%~110% (n=9) for 4-hydroxypyridine and for m-tuloidine, respectively． Conclusion：The method is simple，sensitive, accurate and suitable for the quality control of this drug substance．
[Key words] Torasemide;4-hydroxypyridine;M-tuloidine;RP-HPLC
托拉塞米(torasemide)化学名N-异丙基-[4-(3-甲基)苯胺基吡啶-3-磺酰胺基]甲酰胺，是1993年以来在欧洲许多国家上市的一种新型降压利尿药。在临床上广泛用于治疗高血压、心力衰竭、肾衰、慢性心力衰竭及肝腹腔积液等各种浮肿性疾病(如肝、肺、肾性水肿等)及尿崩症等[1]。
由于在托拉塞米的生产过程中用到4-羟基吡啶与间甲苯胺作起始原料，欧盟对各起始原料残留量有限量规定，为了有效地控制最终产品中这两种物质在托拉塞米产品中的残留，保证产品的质量与用药安全，本文采用高效液相法控制托拉塞米产品中4-羟基吡啶与间甲苯胺的残留量，分析方法灵敏、准确、可靠。
1仪器与试药
Agilent 1100型高效液相色谱仪，包括四元梯度洗脱泵(在线自动脱气)、UV多波长检测器和Chemstation色谱工作站。4-羟基吡啶（分析纯）、间甲苯胺（分析纯）、托拉塞米析料药（本公司生产）、磷酸二氢钾（分析纯）、甲醇（HPLC级）、磷酸（分析纯）
2实验方法及结果
2.1色谱条件及溶液[2，3]
色谱柱：C18，规格：Agilent 15 cm×4.6 mm×5.0 μm。
柱温：室温，流速：1.5 ml/min，检测波长：240 nm，进样量：20 μl。
流动相：0.02 mol/L磷酸二氢钾溶液（用磷酸调pH至3.5）－甲醇(3∶2)。
供试品溶液：精密称取本品20 mg于50 ml量瓶中，加15 ml甲醇超声15 min使溶解，再加0.02 mol/L磷酸二氢钾缓冲液22.5 ml，冷却至室温后，用流动相稀释至刻度，摇匀。
杂质对照贮备溶液：分别称取0.02 g 4-羟基吡啶与间甲苯胺至50 ml量瓶，用流动相溶解并稀释至刻度。则浓度为400 μg/ml，再取此溶液1 ml至10 ml量瓶中，用流动相稀释至刻度，摇匀，则浓度为40 μg/ml。
杂质对照溶液：取杂质对照贮备溶液1 ml至100 ml量瓶中，用流动相稀释至刻度，摇匀，则浓度为0.4 μg/ml。
系统适用性溶液：准确称取托拉塞米对照品20 mg，置50 ml量瓶，加0.5 ml杂质对照贮备溶液（40 μg/ml），用流动相稀释至刻度。
2.2系统适用性及专属性
将流动相溶液、系统适用性溶液进样1针：4-羟基吡啶与间甲苯胺的分离度为10.97，间甲苯胺及托拉塞米的分离度为26.42，分离度均大于2.0。
将杂质对照溶液进样6针，计算4-羟基吡啶、间甲苯胺峰面积的RSD分别为1.19%、3.73%都小于5.0%，符合要求。空白溶液对检测无干扰。此项试验符合要求。各杂质在此试验条件下，得到了很好的分离。
2.3重复性
准确称取托拉塞米样品6份约20 mg，分别置于6个50 ml量瓶中，加15 ml甲醇超声溶解，再加22.5 ml的磷酸二氢钾缓冲液，冷却至室温，用流动相稀释至刻度。将上述6份样品各平行进2针，根据系统适用性项下的对照品溶液6针主峰面积的平均值，计算6份样品中的最大单杂质及杂质总和。6份样品的最大单杂质与总杂质含量的RSD均为0小于15.0%。
2.4检测限及定量限
制备含4-羟基吡啶3.53 μg/ml与间甲苯胺20.24 μg/ml的溶液，再逐级稀释，4-羟基吡啶与间甲苯胺的浓度稀释至信号与噪音的比约为10∶1时，为4-羟基吡啶与间甲苯胺的定量检测限，4-羟基吡啶的信噪比为9.1∶1时的浓度为0.014 μg/ml相当于托拉塞米样品浓度的0.004%；间甲苯胺的信噪比为9.8∶1时的浓度为0.081 μg/ml相当于托拉塞米样品浓度的0.020%。且定量限溶液峰面积RSD分别为3.67%与4.99%，均小于10.0%（n=6）。4-羟基吡啶与间甲苯胺峰的信噪比为3∶1的浓度，即为4-羟基吡啶与间甲苯胺检测限，4-羟基吡啶检测限浓度为0.005 6 μg/ml相当于托拉塞米样品浓度的0.001%，间甲苯胺检测限浓度为0.032 μg/ml，相当于托拉塞米样品浓度的0.008%。
2.5线性范围
2.5.1溶液配制精密称取4-羟基吡啶与间甲苯胺用流动相配制成为浓度分别为41.46 μg/ml与43.90 μg/ml的溶液。精密移取贮备溶液0.5、1.0、2.0、3.0 ml置100 ml量瓶中，配制成线性溶液。各溶液平行进样3针，加上定量限，以样品浓度与峰面积做回归。
2.5.2测定结果4-羟基吡啶的线性方程为：Y=44.656X+0.077 6相关系数r=0.999 9。间甲苯胺的线性方程为：Y=11.575X+0.207 4相关系数r=0.999 1。4-羟基吡啶浓度在0.014~1.244 μg/ml[相当于托拉塞米样品溶液的0.004%(定量检测限)~0.3%]的溶液的峰面积与浓度成线性关系，相关系数r≥0.99。间甲苯胺浓度在0.081~1.317 μg/ml[相当于托拉塞米样品溶液的0.020%(定量检测限)~0.3%]的溶液的峰面积与浓度成线性关系，相关系数r≥0.99。
2.6准确度试验（加样回收率）
2.6.1回收率贮备溶液制备精密称取4-羟基吡啶与间甲苯胺用流动相溶解制成浓度分别为41.08 μg/ml与43.84 μg/ml的溶液。
2.6.2回收率溶液的配制称取托拉塞米20 mg三份，并分别加入相应量的贮备溶液得到3个浓度4-羟基吡啶与间甲苯胺浓度相当于样品溶液的0.05%、0.10%、0.15%回收率1 、回收率2、回收率3，各样品平行进3针，计算4-羟基吡啶、间甲苯胺回收率结果见表1，2。
分别为98.6%、97.2%、96.6%和104.6%、96.7%、93.7%。各浓度下的4-羟基吡啶平均回收率均在90%~110%范围内，间甲苯胺平均回收率均在85%~115%范围内，两种物质三个浓度回收率12个数据的相对标准偏差分别为1.20%和7.10%均不大于10.0%。此试验符合要求。
2.7稳定性
取重复性中的一份样品溶液存放并在5、11、22、48 h平行进2针，计算其杂质含量。与0 h比较考察溶液的稳定性。在5、11、22、48 h样品杂质含量，杂质含量的绝对值均在±0.05%以内，没有出现新的大于定量检测限的杂质。
3讨论
本方法参照了EP5和USP29中托拉塞米有关物质分析方法，选用0.02 mol/L磷酸二氢钾溶液（用磷酸调pH至3.5）－甲醇(3∶2)做流动相，波长240 nm。
4-羟基吡啶浓度在0.014~1.244 μg/ml[相当于托拉塞米样品溶液的0.004%(定量检测限)~0.3%]的溶液的峰面积与浓度成线性关系，相关系数r≥0.99；间甲苯胺浓度在0.081~1.317 μg/ml[相当于托拉塞米样品溶液的0.020%(定量检测限)~0.3%]的溶液的峰面积与浓度成线性关系，相关系数r≥0.99；定量检测限和检测限试验中，信噪比符合规定，能够达到定量检测及检出的要求；各浓度下的4-羟基吡啶，间甲苯胺平均回收率均在90%～110%范围内，三个浓度回收率9个数据的相对标准差均不大于10.0%；样品溶液放置5、11、22、48 h均是稳定的；在整个测试系统中，对照溶液的RSD都小于10%，验证过程中测试系统是稳定的。
因此，本方法针对托拉塞米中起始原料4-羟基吡啶与间甲苯胺均不大于0.1%[4]进行控制具有可行性，能有效地控制托拉塞米成品中4-羟基吡啶与间甲苯胺的残留量，保证产品符合质量标准。
[参考文献]
[1]Shilliday Ilona R，Allison Marjorie EM． Intraplatelet calcium levels in patients with acute renal failure before an after the administration of loop diuretics[J]．Nephrol Dial Transplant，2001，16(3)：552-555.
|
|
|
|
广告服务