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蒜氨酸+蒜酶共同作用对环磷酰胺处理小鼠免疫功能的调节作用
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【妇产科西医学论文】作者：陈锋，顾丹今，陈坚，许晏【摘要】 目的观察蒜氨酸+蒜酶对环磷酰胺所致免疫低下小鼠免疫功能的调节作用。方法环磷酰胺造模法制作免疫抑制小鼠模型，给药10 d，测定小鼠腹腔巨噬细胞吞噬率、血清溶血素、脾淋巴细胞增殖功能及血清IL-2含量，观察蒜氨酸+蒜酶对小鼠免疫功能的影响。结果与模型组比较，蒜氨酸+蒜酶在中、高剂量可明显提高环磷酰胺所致免疫低下小鼠的腹腔巨噬细胞吞噬率，也可促进血清溶血素形成和脾淋巴细胞的增殖，高剂量可提高血清IL-2含量。结论蒜氨酸+蒜酶对环磷酰胺处理小鼠免疫功能低下有免疫保护作用。
【关键词】 蒜氨酸；蒜酶；环磷酰胺；免疫功能
Abstract：ObjectiveTo observe the effect of alliin+alliinase from garlic on immunological function in immunosuppressive model mice caused by cyclophosphamide. MethodsThe IS model in NIH mice were induced by cycolphosphamide:Mice were administered with alliin+alliinase for 10 days. The phagocytosis ability of macrophare, serum hemolysin concentration, the spleen lymphcells transformation and the level of IL-2 in serum were measured.Results The results showed that alliin+alliinase at the middle and high dose could cause a significant increase of the phagocytic rate, the proliferation of spleenocytees and the serum hemolysin, alliin+alliinase at high dose could increase the level of IL-2. ConclusionAlliin+alliinase can stimulate the immunologic function of IS mice
Key words：Alliin; Alliinase; Cycolphosphamide; Immunological function
大蒜是百合科葱属多年生草本植物，作为药食两用历史悠久。现代医学证明大蒜主要具有抗感染、抗肿瘤和防治心脑血管疾病等3大功效。目前公认大蒜的生物活性成分主要是蒜酶（alliinase) 催化蒜氨酸产生的大蒜辣素(allicin) 、阿霍烯(ajoene) 等系列含硫有机化合物［1］。大蒜的抗肿瘤作用与其免疫调节作用有关。大蒜不同制剂对机体免疫功能的影响已有广泛报道。本实验研究了蒜氨酸+蒜酶对环磷酰胺所致免疫受抑小鼠免疫功能的调节作用。
1 材料
1.1 动物NIH小鼠，(20±2) g ，雌雄兼用，购自新疆医科大学动物实验中心。
1.2 药物蒜氨酸及蒜酶单体由新疆医科大学药学院采用新疆地产大蒜提取并纯化。蒜氨酸与蒜酶以2∶1 比例经双蒸水混合,35℃水浴反应30 min，形成纯品大蒜辣素(称做蒜氨酸+ 蒜酶) ，根据预实验结果确定(125+ 63)，(250+125)，(500+ 250) mg·kg-1等低、中、高3个剂量。
1.3 试剂环磷酰胺(CP)购自上海华联制药有限公司;绵羊红细胞悬液(SRBC) :由新疆医科大学动物实验中心提供。Alsever's 血球保存液:按常规配制。都氏试剂: NaHCO3 1.0 g ，KCN 0.05 g，高铁氰化钾0.2 g ，加水至1 L 。4℃保存。豚鼠补体:多个豚鼠心脏采血，分离血清，混合。按血清:绵羊红细胞= 20∶1 的比例加入压积SRBC中，4℃放置20 min。2 000 r/min，离心10 min，吸取上清液，生理盐水稀释8 倍。
2 方法
2.1 分组随机将50只NIH小鼠分成蒜氨酸+蒜酶(低，中，高剂量)
剂量组及正常对照组和模型组，共5组，每组10只。正常对照组每日用生理盐水(20 mg·kg-1) 灌胃，共10 d；模型组每日用生理盐水(20 mg·kg-1) 灌胃，共10 d，并在第7天开始同时腹腔注射环磷酰胺(17.5 mg·kg-1) ，共4d；各给药组分别用不同剂量的蒜氨酸+ 蒜酶给相应各组小鼠灌胃，持续10 d，并在第7天开始同时腹腔注射环磷酰胺(17.5 mg·kg-1) ，共计4 d。第11天测定各项免疫指标。
2.2 小鼠腹腔巨噬细胞吞噬功能的测定［2］
小鼠腹腔注射1%鸡红细胞，1 ml/只；30 min 后，再腹腔注射生理盐水1 ml /只，断颈处死小鼠，吸取腹腔液、涂片，1∶1 丙酮甲醇固定5 min ，Gimesa 染色，油镜观察。每份标本油镜下观察200个巨噬细胞，计算吞噬鸡红细胞的巨噬细胞百分率。吞噬率（%）=(吞噬鸡红细胞的巨噬细胞数/200个巨噬细胞)×100%。
2.3 对小鼠淋巴细胞增殖的影响
应用MTT 法［3，4］。处死小鼠用75%酒精浸泡5 min，无菌操作取脾, 置hank's液中于200目网中研磨,用完全1640培养液配成5×106/ml细胞悬液。每份标本设3个平行孔。每孔加100 μl细胞悬液和100 μl ConA/LPS，并设细胞对照。37℃,5 %CO2 孵育68 h，加 MTT (5 mg/ ml) 20 μl/孔。继续培养3 h ,离心 ,1 500 rm/min，5 min，弃上清，每孔加100 μl二甲基亚砜 (DMSO)振荡15 min，于酶标仪570 nm处测OD值。
2.4 小鼠血清溶血素的测定［5］
给药第6天，小鼠腹腔注射3∶5 (V∶V) SRBC。第11天，取小鼠眼球血，离心(2000 r/min离心，10 min) ,获得待测血清。将血清做1∶300 稀释,将此血清样品1 ml与10%SRBC 0.5 ml ，1∶8 补体1 ml混和。37℃水浴30 min ，冰浴终止反应,2 000 r/min，10 min ，取上清液l ml加都氏试剂3 ml ，于酶标仪570 nm 处测A值。计算小鼠的半数溶血值(HC50)。
样品HC50 =(样品的吸收度值/SRBC半数溶血时的吸收度值)×稀释倍数
2.5 小鼠血清IL-2测定
取小鼠眼球血，离心(2 000 r/min，10 min) ,分离血清待测。采用ELISA试剂盒检测：双抗体夹心法。
2.6 统计学分析
实验数据以±s 表示。利用PEM211软件进行单因素多组方差分析和Q 检验。
3 结果
3.1 对小鼠腹腔巨噬细胞吞噬功能的影响
表1结果显示模型组吞噬百分率明显降低,与正常对照组比较有显著差异 ( P<0.05) ,说明免疫受抑小鼠模型成立。中、高剂量的蒜氨酸+蒜酶组小鼠腹腔巨噬细胞的吞噬百分率明显提高，与模型组相比有显著差异(P<0.05) ，与蒜氨酸+蒜酶低剂量组相比也有显著差异( P<0.05) 。表1 蒜氨酸+ 蒜酶对CP 处理小鼠腹腔巨噬细胞功能的影响（略）
3.2 对小鼠淋巴细胞增殖的影响
表2结果显示，模型组淋巴细胞增殖程度明显降低，与正常对照组比较差异有显著意义( P<0.05)，说明免疫受抑小鼠模型成立。中、高剂量的蒜氨酸+蒜酶可明显促进淋巴细胞增殖，与模型组相比有显著差异( P<0.05)。表2 蒜氨酸+ 蒜酶对CP 处理小鼠脾淋巴细胞增殖的影响（略）
3.3 对小鼠血清溶血素形成的影响
表3结果显示，模型组溶血素明显降低，与正常对照组比较差异有显著意义(P <0.05) ，说明免疫受抑小鼠模型成立。中、高剂量蒜氨酸+蒜酶组溶血素的形成显著增加，与模型组相比有显著差异(P<0.05)。表3 蒜氨酸+ 蒜酶对CP处理小鼠血清溶血素和IL-2的影响（略）
3.4 小鼠血清IL-2测定
表3结果表明，模型组IL-2含量明显降低，与正常对照组比较有显著意义（P ﹤0.05），说明免疫受抑小鼠模型建立。高剂量蒜氨酸+蒜酶可提高血清IL-2水平，与模型组相比有显著差异（P ﹤0.05）。
4 讨论
大蒜及其含硫化合物的抗肿瘤活性已为大量实验所证实，其抗肿瘤机理复杂，大蒜对免疫系统的调节作用也是其抗肿瘤重要机理之一。有文献报道大蒜提取物可提高机体免疫功能［6～8］。Truchlinski等［9］报道大蒜提取物、1,2,4-triasole 衍生物和紫锥花汁均可增强母火鸡的非特异免疫功能，可提高吞噬细胞百分率、NBT阳性颗粒和溶酶体含量；其中大蒜提取物的增强作用最强。本实验检测了蒜氨酸+蒜酶对免疫受抑小鼠腹腔巨噬细胞的吞噬率的影响，结果表明中、高剂量的蒜氨酸+蒜酶可明显提高免疫受抑小鼠腹腔巨噬细胞的吞噬率，此结果与Truchlinski的结果是一致的，说明蒜氨酸+蒜酶可提高巨噬细胞的吞噬功能，增强机体的非特异性免疫力。
当肿瘤发生后， 机体可通过免疫效应机制发挥抗肿瘤作用。在体内宿主对肿瘤的免疫应答效应是细胞免疫和体液免疫对肿瘤作用的综合结果。一般认为细胞免疫是抗肿瘤免疫的主力。本实验结果表明中、高剂量的蒜氨酸+蒜酶可显著促进免疫受抑小鼠脾脏淋巴细胞转化、提高HC50水平，提示蒜氨酸+蒜酶对免疫受抑小鼠的细胞免疫、体液免疫功能均有增强作用。在特异性免疫应答中， 细胞因子的辅助是必不可少的。IL-2是在机体复杂的免疫网络中起调节作用的重要细胞因子。主要由C的TH细胞合成和分泌，可促进多种T细胞亚类的增殖和分化， 促进多种细胞因子或其受体的表达。实验结果表明，高剂量的蒜氨酸+蒜酶可提高血清IL-2，这与文献报道一致［10］。
本实验表明蒜氨酸+蒜酶对环磷酰胺所致免疫功能低下有免疫保护作用，对其非特异免疫、特异性免疫都有上调作用。
【参考文献】
［1］Manabe T, Hasumi A, Sugiyama M, et al.Alliinase ［S-alk(en)yl-L-cysteine sulfoxide lyase］ from Allium tuberosum (Chinese chive)-purification, localization, cDNA cloning and heterologous functional expression［J］.Eur J Biochem,1998 ,257(1):21.
［2］陈奇.中药药理实验方法学［M］.北京:人民卫生出版社,1993：315.
［3］徐叔云, 卞如濂, 陈修. 药理实验方法学，第2版［M］.北京:人民卫生出版社, 1991：1221.
［4］郑永唐, 贲昆龙. 测定细胞存活和增殖的MTT方法的建立［J］. 免疫学杂志, 1992 , 8 (4) : 266.
［5］沈关心,周汝麟.现代免疫学实验技术，第2 版［M］. 武汉:湖北科学技术出版社,2002:396.
［6］Colic M,Savic M.Garlic extracts stimulate proliferation of rat lymphocyte in vitro increasing IL-2 and IL-4 production.Immunopharmacol［J］. Immunopharmacol-Immunotoxicol,2000 ,22(1): 163.
［7］Morioka, N., Sze, L. L., Morton, D. L. et al. Protein fraction from aged garlic extract enhances cytotoxicity and proliferation of human lymphocytes mediated by interleukin-2 and concanavalin A［J］. Cancer Immunol Immunother. 1993 ,37(5)：316.
［8］Patya M, Zahalka MA, Vanichkin A, et al. Allicin stimulates lymphocytes and elicits an antitumor effect: a possible role of p21ras［J］. Int Immunol,2004,16(2):275.
［9］Truchlinski J, Krauze M, Cendrowska-Pinkosz M,et al. Influence of garlic, synthetic 1,2,4-triasole derivative and herbal preparation echinovit C on selected indices of turkey-hens non-specific immunity［J］.Pol J Vet Sci,2006,9(1):51.
［10］Lamm DL , Riggs DR. The potential application of Allium sativum(garlic) for the treatment of bladder cancer［J］. Urol Clin North Am,2000 ,27 : 157.
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