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牙龈卟啉单胞菌菌毛蛋白fimA基因在大肠杆菌中的融合表达和纯化(二)

【小学数学学困生论文】5)金属螯合亲和层析用于蛋白质的复性在基因工程技术中,表达的重组蛋白多以包涵体形式存在,蛋白质经常会错误折叠而丧失活性,这一难题长久以来都没有得到很好的解决。高浓度的变性剂可以溶解包涵体,然后控制变性剂除去的速度,有时需要添加适当的氧化/还原试剂,蛋白质可以逐步折叠复性。通常使用的复性方法有三种,分别是稀释复性、透析复性和层析复性。
(1)稀释复性:直接把溶解的蛋白质稀释于复性缓冲液中。这种方法操作简单,适于小规模使用,但只适于浓度极低的蛋白质复性,否则会有大量聚集体形成。
(2)透析复性:采用透析膜通过逐渐降低外透液浓度来控制变性剂去除速度。这种方法速度慢、耗时长,不适合大规模使用,有时易形成无活性蛋白聚集体。
(3)层析复性:使蛋白质可逆吸附在固相介质上,例如离子交换层析介质、金属螯合亲和层析介质等,可以避免伸展的多肽分子之间形成聚集体。金属螯合亲和层析(IMAC)是一种有效的纯化和复性蛋白质的层析方法。在高浓度变性剂存在的情况下,组氨酸尾仍旧具有吸附在金属螯合亲和层析介质上的能力,所以可在IMAC介质上同时实现复性与纯化[112-116]。蛋白质吸附在IMAC介质后,先逐步降低变性剂的浓度,使蛋白质折叠,然后提高咪唑浓度把折叠后的蛋白质洗脱出来。对于TNF蛋白,使用IMAC获得了90%的复性收率[73]。
2.6 小结
大肠杆菌系统由于其遗传学、生物化学和分子生物学方面已充分被人们了解而成为表达许多异源蛋白质的首选表达系统。在过去的20多年中,用各种载体系统在大肠杆菌中表达了数百种重组蛋白。融合标签不但可提高重组蛋白的产量,还可增强重组蛋白质的可溶性。融合标签技术的发展使重组蛋白质的纯化更加快速、简便。随着金属螯合亲和层析技术的不断发展和改进,目前,固定化金属螯合亲和层析技术已成为蛋白质,特别是基因重组蛋白和多肽分离纯化最有效的工具之一。
本课题组已成功构建了Pg菌毛蛋白fimA基因的原核表达质粒pET-15b-fimA,本研究在此基础上,拟将此质粒在大肠杆菌BL21(DE3)pL
 
 
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