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一株病原菌的API生化鉴定及其16S—23S rDNA间区序列分析
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【超声中医学论文】2008年3月,湖北省荆门市京山县某村居民发生一起急性腹泻事件,这些病人生活饮用水均来自一河流水,京山县疾病预防控制中心从水中分离出一株细菌,用API20E生化试纸条鉴定为可疑生化谱,可能为河流弧菌。以细菌16S rDNA3’端和23S rDNA5’端的高度保守区为引物, PCR扩增出该菌的16S—23S rDNA间区( intergenic spacer IGS),克隆到pMD-18-T载体上,测序,采用BLAST在线同源性查询软件对16S—23S rDNA间区序列进行比较分析,最后鉴定为嗜水气单胞菌。 该试验旨在建立针对生化鉴定结果不准确的情况下,利用分子生物学手段进地鉴定。为实际工作中病原菌的快速检测、大规模检疫、流行病学的调查等提供新的检测思路和手段。1 材料与方法 1. 1 菌株来源 由湖北省荆门市京山县疾病预防控制中心从一起造成村民急性腹泻的河流中分离所得。 1. 2 生化试剂和仪器 培养基制备按照GB 4789-2003执行。法国梅里埃API 20E生化鉴定系统,珠海黑马公司产Hema-480PCR仪, pMD-18 T载体,美国加州α公司产Alpha-120凝胶成像仪。 1. 3 增菌分离 将标本接种至氯化镁孔雀绿增菌液(MM)GN肉汤、EC肉汤和碱性蛋白胨水中37℃、24 h培养,转种SS、寿康凯(MAC)平板, 37℃、24 h培养。分离到纯菌落为止。 1. 4 形态学观察 观察细菌在各种平板上的菌落形态,挑取菌落进行革兰染色,观察染色结果。 1. 5 生化鉴定 做氧化酶试验,并用该菌的新鲜培养物接种API 20E肠杆菌科生化试纸条做生化鉴定。 1. 6 分子生物学鉴定 1. 6. 1 菌株培养 将该菌用肉汤液体培养基中(30℃)220r/min振荡培养18~20 h。 1. 6. 2 模板DNA的制备 取1. 5 ml菌液, 4000 r/min(最大离心力20 800&tim
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