| | | 鸭乙型肝炎病毒全基因重组质粒构建及表达
| | 小论文下载 作者：胡权,张正茂,张小勇,张振华,雷延昌,周敦金,黄建国,杨东亮
【摘要】 目的小论文下载 构建鸭乙型肝炎病毒（DHBV）感染性克隆，通过体外细胞转染获得单一来源、基因序列清楚的小论文下载体内实验的感染毒种。方法 以湖北麻鸭DHBV分离株（DQ276978）为模板，用PCR法从该DHBV全基因组克隆质粒（pMD-DHBV）和DHBV阳性血清中获取3部分基因片段，总长44kb，克隆至载体PCR21的SacI和NotI酶切位点，构建含15倍鸭乙型肝炎病毒全基因的重组质粒，并酶切鉴定其插入方向。将构建的重组质粒经脂质体LipofectineTM 2000导入鸡肝癌细胞系(LMH)细胞中转染表达，收集纯化后的转染细胞培养上清液作为体内实验感染的标准毒种。结果 PCR鉴定、酶切鉴定及序列测定，证实成功获得正向插入的1.5倍鸭乙型肝炎病毒全基因重组质粒PCR2.1-DHBV1.5。Southernblot检测表明，该重组质粒在LMH细胞内存在各种病毒复制中间体；通过电镜观察，转染细胞上清液中存在DHBV完整病毒颗粒。结论 经体外重组，构建出携带1.5倍加长DHBV基因组片段的重组质粒PCR21-DHBV15，并可在鸡肝癌细胞LMH中介导高水平病毒复制，从而获得含可自我复制病毒颗粒的转染细胞上清液作为动物体内感染接种物。
【关键词】 鸭乙型肝炎病毒
鸭乙型肝炎病毒（DHBV）与人类乙型肝炎病毒（HBV）同属嗜肝DNA病毒科，它们在形态结构、基因序列、病毒复制、致病机制及感染宿主规律等方面均较为相似，DHBV感染鸭模型使人们认识了嗜肝病毒的复制周期以及病毒持续存在和病毒彻底清除的机制。我们在对湖北麻鸭DHBV自然感染率调查的基础上，选择对DHBV易感且取材方便的湖北麻鸭作为实验鸭种，并分离出1株DHBV新毒株（DQ276978）〔1〕。进而以该毒株为模板，构建了15倍DHBV全基因重组质粒，通过该质粒在鸡肝癌细胞系(LMH)中稳定转染表达出含有可自我复制的病毒颗粒的细胞培养上清液作为单一来源、基因序列清楚的实验毒种，以期建立标准化的湖北麻鸭乙型肝炎病毒体内模型。另外，将该DHBV重组质粒与不同剂量人类载脂蛋白BmRNA编辑酶催化多肽3G(APOBEC3G)真核表达质粒共转染LMH细胞，通过抑制实验以证实该DHBV体外实验模型的初步应用。
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