| | | 核酸扩增技术在结核病诊断中的应用与进展
| | 论文下载近10余年来现代分子生物学的论文下载迅猛发展，为临床实验室诊断提供了较为可靠的论文下载核酸检测方法。经典聚合酶链反应(PCR)扩增技术已广泛应用于结核病的诊断；然而，由于污染问题严重，扩增抑制物的存在，试剂盒缺乏规范化、标准化，加之技术、条件、质控等方面因素影响，其敏感性、特异性差异颇大，人们对其可信度、可靠性产生了怀疑，给临床医生诊断结核病带来了一定的困惑。为此，国外学者开发出具有高度敏感性、特异性、标准化、商品化的PCR扩增试剂盒；继PCR之后，又发展了几种新的核酸体外扩增技术。现就其在结核病诊断方面的应用与进展作一介绍，供广大同道借鉴。
一、PCR为基础扩增反应即Roche Amplicor结核分支杆菌PCR试验(Amplicor pCR)
Amplicor PCR系应用生物素标记位于结核分支杆菌16S rRNA基因中高度保守区域种特异性引物扩增结核分支杆菌复合群DNA中584 bp序列；生物素标记的扩增子(amplicon)与种特异性DNA探针进行杂交后，应用标准酶联免疫技术进行比色鉴定，结果判断以450 nm波长时吸光度(A450)＞0.350为阳性标准［1～3］。Amplicor pCR是由瑞士Roche公司开发研制的标准化、商品化试剂盒，该试剂盒有三个不同的小盒：标本处理盒、扩增盒和鉴定盒。为防止交叉污染，厂商推荐试剂制备、标本处理、扩增与鉴定应三室分开，此外，应用尿嘧啶-N-糖基化酶控制扩增子携带污染。研究表明，Amplicor pCR可检出少至2～10个结核分支杆菌中DNA。与培养法相比，Amplicor pCR检测临床标本中结核分支杆菌DNA的敏感性为76.7%～97.8%，特异性达97.7%～99.3%，阳性预计值(PPV)66%～93%，阴性预计值(NPV)98%～98.6%［2～4，6］。若参考临床综合诊断，其敏感性、特异性、PPV、NPV分别为66.7%～85.4%、99.6%～100%、91.7%～100%、96.8%～98.6%，该方法至少与培养法一样敏感［1，4～6］。对于涂阳标本，Amplicor pCR敏感性(97.6%～98%)显著高于涂阴标本(40%～53%)［4，6］。该方法还可对涂阳标本应用种特异性探针对结核分支杆菌和非结核分支杆菌(MOTT)早期进行菌种鉴定［2，4］。Amplicor pCR整个过程仅需7小时左右，用于检测BACTEC培养基中结核分支杆菌较核酸探针杂交试验提前4天以上［4］。法国学者Carpentier等［5］对Amplicor pCR进行多中心研究，结果显示，其检测肺外标本(尿、胸腹液、脑脊液等)、涂阳标本、涂阴标本及培阳标本的敏感性分别为83%、94.5%、74%、95%，特异性达98%。Amplicor pCR不仅具有高度敏感性、特异性和可重复性，而且操作简单，无需昂贵设备，无放射性污染问题；然而，其灵敏度较经典PCR稍低，可能系标本量较少及存在抑制因子所致。Amplicor pCR在方法学上仍需进一步自动化以避免手工重复操作。
|
| | |
| | | | <<<<<全文未完>>>>> 全文字数约$$$zishu$$$字 | |
| | |
| |
|
教育论文中心