| | | 非核素标记检测端粒酶活性的研究
| | 药学本科毕业论文Kim［1］于1994年借助PCR技术建立了灵敏的药学本科毕业论文端粒酶检测方法——端粒重复片段扩增(telomerase repeat amplification protocol，TRAP)。我们对Kim的药学本科毕业论文方法加以改进，建立了简便、非同位素的银染检测法，检测了脑瘤、肠癌、食管癌中端粒酶的活性。
一、材料与方法
1.总蛋白提取：手术后取下的活组织，液氮保存。(1)100 ml提取液中含10 mmol/L Tris-HCl (pH 7.5)；1 mmol/L MgCl2；1 mmol/L EGTA,0.5 mmol/L β-巯基乙醇；0.5% CHAPS，体积分数为10%的甘油。(2)组织中提取总蛋白：取约30 mg组织用无菌眼科手术剪尽量剪碎，加入200 μl提取液，冰浴30 min后，4 ℃ 1 600 g离心20 min。吸取上清约150 μl待测。
2.TRAP反应：(1)引物及稀释：RNA模板逆转录引物TS：5′-AATCCGTCGAGCAGAGTT-3′18mer，MW=5 524，浓度为0.541 g/L。PCR引物CX：5′-CCTTACCCTTACCCTTACCC
TAA3′24mer,MW=7 104,浓度为0.688 g/L。(2)PCR扩增：①将Kim［1］的方法改进为：50 μl PCR液含20 mmol/L Tris-HCl (pH8.3);1.5 mmol/L MgCl2;63 mmol/L KCl;0.005%Tween-20;1 mmol/L EGTA;200 μmmol/L dNTP;0.1 μgT4 g32 蛋白;0.1 μg/L牛血清白蛋白;0.1 μg TS引物;2 U Taqase;0.5～1.0 mg总蛋白。②25℃ 20 min，加入0.1 μg CX引物。③94℃预变性5 min，94℃30 s→50℃ s→72℃90 s 30个循坏，72℃延伸10 min。
3.电泳:12%非变性聚丙烯酰胺凝胶，取10 μl PCR产物，加2 μl 6×Lodding buffer,150 V恒压2 h。
4.银染:(1)固定：胶在10%冰乙酸中，洗1次。(2)银染：0.2%AgNO3 300 ml，加入0.5 ml甲醛，染色10 min，洗1次。(3)显色：3%Na2CO3 300 ml,加甲醛0.5 ml，显色至清晰。(4)终止：10%冰乙酸300 ml，终止显色。
二、结果
用非核素TRAP-银染端粒酶活性检测法分析45例手术标本，脑肿瘤阳性率为70.58%(12/17)，肠癌阳性率为84.62%(11/13)，食管癌阳性率为90%(9/10)，食管癌旁组织阳性率为90%(4/5)，用2种方法对15例标本对比检测，TRAP-ELISA法检出9例阳性，TRAP-银染法检出9例阳性 ，结果一致。
三、讨论
端粒酶活性检测常用Kim［1］的TRAP法，在PCR过程中掺入同位素标记α-32P dGTP/dCTP，产物聚丙烯酰胺凝胶电泳，放射自显影显示相差6个核苷酸的DNA ladder条带，以判断端粒酶活性。该方法敏感，已被国际上多家实验室采用，但由于应用核素，造成检测周期长(约7周)，污染环境，要求有特殊而专一的实验室，使其 广泛应用受到限制。为此，我们对Kim［1］的方法进行改进，建立了不需加入核素，直接进行RT-PCR扩增，产物电泳后硝酸银染色，显示DNA梯状电泳带的方法。同时应用保灵曼公司的TRAP-ELISA端粒酶活性半定量法，对照检测。两种方法对比检测结果一致。说明我们的方法同样敏感、准确，且简便易推广。
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