| | | 负载hTERT复制缺陷型腺病毒的包装及鉴定
| | 药学专科毕业论文 作者：陈陵，向国春，李向红，蔡永国，李晶晶，房殿春，罗元辉，李志宏，杨仕明
【关键词】 腺病毒表达载体
Package and identification of replicationdeficient recombinant adenovirus expression vector of hTERT
【Abstract】 AIM: To construct a replicationdeficient recombinant adenovirus expression vector of hTERT (AdhTERT). METHODS: The hTERT gene was cloned at the downstream of CMV promoter of the adenoviral shuttle plasmid pDC315 in sense direction and the resultant recombinant plasmid pDC315hTERT was cotransfected into HEK 293 cells together with plasmid pBHGlox (deltaE1, 3) containing adenoviral genome. The adenovirus expression vector was then obtained and identified by infection test, electron microscopic observation and PCR coamplification. RESULTS: After purification and concintration, the titer of AdhTERT reached 5×1012 pfu/L. Virus particles could be found in HEK 293 cells under transmission electron microscope. Both adenovirus and hTERT special fragments could be amplified from AdhTERT by PCR, whereas hTERT special fragment could not be amplified from the control. CONCLUSION: The replicationdeficient recombinant adenovirus expression vector of hTERT is successfully constructed.
【Keywords】 human telomerase reverse transcriptase; adenovirus expression vector
【摘要】 目的药学专科毕业论文: 构建负载人端粒酶逆转录酶(hTERT)基因的药学专科毕业论文复制缺陷型腺病毒.方法: 将克隆有正义hTERT cDNA的腺病毒穿梭质粒pDC315hTERT与腺病毒包装质粒pBHGloxDeltaE1,3Cre共转染人胚肾293细胞(HEK 293), 包装负载hTERT基因的复制缺陷型腺病毒表达载体（AdhTERT）. 对AdhTERT扩增、纯化并浓缩后，进一步行感染性鉴定、电镜鉴定及双引物PCR鉴定. 结果: 纯化浓缩后的AdhTERT滴度可达5×1012 pfu/L. 电镜下可见在HEK 293细胞中形成的病毒颗粒，PCR双引物鉴定AdhTERT可扩增出Ad及hTERT特异片段，而对照则不能扩出hTERT片段. 结论: 成功构建了负载hTERT基因的复制缺陷型腺病毒.
【关键词】 人端粒酶逆转录酶；腺病毒表达载体
0引言
人端粒酶逆转录酶(human telomerase reverse transcriptase, hTERT) Mr 127 000，包含1132个氨基酸，其基因位于5号染色体短臂的最末端（5p15.33），在90%以上的人类肿瘤中高表达，而正常成熟组织中则基本没有表达［1］，因而hTERT是一很有前景的广谱、特异的抗肿瘤治疗靶点. 腺病毒载体系统具有宿主范围广、感染率高、包装容量大、繁殖滴度高、不发生整合及安全性好、性质稳定、载体制备较容易等特点, 目前已成为继逆转录病毒载体后被广泛应用的载体系统［2］，可用作hTERT的异位表达工具. 我们通过构建hTERT腺病毒表达载体，为进一步研究以hTERT为靶点的肿瘤免疫治疗奠定基础.
1材料和方法
1.1材料
负载hTERT基因的正义复制缺陷型腺病毒穿梭质粒pDC315shTERT由本室构建保存［3］；腺病毒包装质粒pBHGloxDeltaE1,3Cre和转化有腺病毒E1区基因的包装细胞HEK 293均由第三军医大学全军免疫学研究所邹强博士惠赠;大肠杆菌DH5α由本室保存. HindⅢ, BamH I, Taq DNA聚合酶、dNTP, Plasmid Purification Kit (Promega公司); DGL2000 DNA Marker (北京鼎国试剂公司);质粒DNA小量快速抽提kit (Omega公司)；脂质体DOTAP (Roche公司)； 高糖DMEM (Gibco公司); 胎牛血清(HyClone公司); 酵母提取物及胰蛋白胨(上海生物工程公司); 低溶点琼脂糖(西班牙进口分装); 氨苄青霉素(华北制药厂). hTERT的PCR引物(144 bp)为P1：5′ CGGAAGAGTGTCTGGAGCAA 3′,P2: 5′GGATGAAGCGGAGTCTGGA 3′，腺病毒E2b区引物（860 bp）为P3: 5′TCGTTTCTCAGCAGCTGTTG 3′, P4:5′CATCTGAACTCAAAGCGTGG 3′,均由上海生物工程公司合成并纯化，纯度达99.5%. AdLacZ空病毒：克隆有β半乳糖苷酶（βgal）基因LacZ，由西南医院心内科唐兵博士惠赠.
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