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凋亡蛋白Daxx与TRAF3相互作用的筛选及相互作用位点的鉴定

【西医学免费论文下载】 作者:张翠莉,成海恩,王应雄【摘要】 目的: 利用酵母双杂交技术在成人肝文库中筛选能与死亡结构域相关蛋白(Daxx)相互作用的蛋白,并用哺乳动物细胞中进行了免疫共沉淀验证,以进一步了解Daxx的功能. 方法: 利用PCR在成人肝cDNA文库中扩增Daxx全长ORF,构建pDBLeuDaxx载体. 转化MaV203,检测细胞毒性和自激活作用,确定His基础表达的3AT浓度. 依次转化成人肝cDNA文库. 在营养缺陷型培养基上挑取三阳性克隆. 进行回转实验和免疫共沉淀验证,并利用βgal分析进行了相互作用结构域的鉴定. 结果: 筛库转化效率达到5.8×106个克隆. 筛选到了一株能与Daxx相互作用的阳性克隆,DNA序列分析和同源检索表明该阳性克隆为肿瘤坏死因子受体相关因子3(TRAF3).通过回转及coIP证实了TRAF3能与Daxx相互作用,βgal分析发现TRAF3通过TRAF Domain与Daxx相互作用. 结论: TRAF3通过TRAF Domain与Daxx相互作用,可能参与了Daxx的调控和功能,为进一步了解Daxx作用的分子机制奠定了基础.
【关键词】 凋亡
0引言
死亡结构域相关蛋白(death domainassociated protein, Daxx)在核内作为转录调控子发挥促凋亡作用[1 ];另一方面,在各种凋亡刺激下,Daxx可以从核转移到胞质中,介导肿瘤坏死因子受体(TNFR) 超家族成员促凋亡信号的转导. Daxx和FADD分别是Fas下游的两条截然不同的凋亡通路. Daxx通过活化JNK通路,不依赖于caspase,参与凋亡的活化[2]. 随着大量的研究,Daxx的促凋亡功能受到了挑战. 如Michaelson等[3]发现缺乏Daxx 基因的鼠胚胎发育受损,大量胚胎干细胞系出现凋亡,他提出Daxx基因是胚胎发育所必需的,直接或间接起着防止凋亡的作用. 由于Daxx在凋亡方面矛盾的功能,通过对Daxx和其他蛋白质之间相互作用的研究,来了解Daxx
 
 
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