| | | 脆弱类杆菌荧光定量PCR法检测
| | 医学论文【关键词】 脆弱类杆菌；荧光定量PCR；SYBR,Green,I
摘要： 目的医学论文 探讨荧光定量PCR技术检测脆弱类杆菌。方法 用特异性引物和荧光染料实时PCR扩增并检测产物。结果 脆弱类杆菌标准株(ATCC 25285)和4株分离株均有特异扩增曲线，灵敏度达 102个菌；而大肠埃希菌、保加利亚乳杆菌、嗜热链球菌无特异扩增曲线。结论 荧光染料实时PCR技术可特异并定量检测脆弱类杆菌
关键词： 脆弱类杆菌；荧光定量PCR；SYBR Green I
Detection bacteria fragile by SYBR Green real-time PCR
Abstract： Objective To identify the bacteria fragiles(B.fragiles)by 16S target rRNA realtime PCR.Methods A pair of specific primers was designed.The PCR products were detected by fluorescent quantificative realtime PCR.Results The B.fragilis ATCC 25285 and 4 separative strains of B.fragilis appeared in the special amplification product curve,while E.coli,L.bulgaricus and S.thermophilus did not.The flourescent qantificative PCR can detect 102 bacteria.Conclusion 16S rRNAtargeted primer and fluorescent quantifive realtime PCR can be applicable for the identification and quantification of B.fragilis.
Key words：bacteria fragile;fluorescent quatititive PCR;SYBR Green I
脆弱类杆菌是G-性无芽孢厌氧菌中最常见临床分离株，常规厌氧培养分离需2～7d，不能及时指导临床辨别病原菌。细菌分子生物学技术的医学论文发展为检测细菌感染提供了早期特异敏感的检测方法〔1〕。本文采用荧光定量PCR检测脆弱类杆菌的16S rRNA基因。结果报告如下。
1 材料与方法
11 材料
111 菌株与培养 脆弱类杆菌ATCC 25285（复旦大学医学院）；脆弱类杆菌临床分离株4株，选用拟杆菌（Bd）培养基厌氧培养鉴定；保加利亚乳杆菌CICC 6047、嗜热链球菌CICC 6038、大肠埃希菌ATCC 25922各1株，选用双歧杆菌（BL）培养基培养。
112 仪器与试剂 定量PCR扩增仪及配套分析软件（Gene Amp 5700,美国Perkin-Elmer公司），离心机；细菌基因组提取试剂盒、Ex Taq DNA聚合酶、10×缓冲液、SYBR Premix Ex TaqTM（perfect Real-time）荧光染料〔TakaRa宝生物工程（大连）有限公司〕。
12 方法
121 引物设计 在16S rRNA 序列中第831-864位点和982-1007位点，通过分析软件Blast(http://wwwncbinlmnihgov)同GenBank中大肠埃希菌等基因序列相比较，参照文献〔2〕设计特异性引物。正向引物：F:5′-gaaagcattaagtattccacctg-3′；反向引物：R:5′-cggtgattggtcactgaca-3′，由TakaRa宝生物工程（大连）有限公司合成。
122 特异性测定 分别取不同试验菌增菌培养液，按提取试剂盒说明书进行细菌基因提取，使每1μl提取液中含有106个细菌的DNA，进行荧光定量PCR。
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