| | | 基因改造中快速PCR定点突变方法应用
| | 药学专业毕业论文【关键词】 铜锌超氧化物歧化酶
铜锌超氧化物歧化酶(Cu，Zn-SOD)因为可以消除O- ・2而被广泛应用于延缓衰老和控制炎症，但是由于多种因素影响，尤其是Cu，Zn-SOD具有种质特异性以及在体内停留时间短(通常只有6～10min)，使得Cu，Zn-SOD的药学专业毕业论文应用受到很大限制。定点突变技术是改造、优化基因常用的药学专业毕业论文手段，也是研究蛋白质结构和功能之间复杂关系的有效方法，在医学上还可用于基因治疗等。目前常用的定点突变方法有寡核苷酸引物介导的定点突变、重叠延伸PCR定点突变及盒式突变等〔1〕。但由于这些方法操作繁琐，意外突变多等缺陷，使定点突变的实验受到一定限制。本研究采用一种近年来新的定点突变技术―快速PCR定点突变方法成功地对hCu，Zn-SOD进行了基因改良(将hCu，Zn-SOD基因中非活性中心的Cys111密码子突变为Ala密码子，以提高其稳定性)，同时对该定点突变技术要点进行探讨。
1 材料
11 菌株与质粒 E.coli DH5α，由本实验室保存。质粒pESOD(含hCu，Zn-SOD基因、Ampr基因以及EcoRI酶切位点，整个质粒约33kb)由本实验室构建，并转化于E.coli DH5α保存。
12 主要试剂 Pfu高保真DNA聚合酶(深圳晶美生物工程有限公司)；DpnI酶(河南华美生物工程有限公司);小量质粒快速抽提纯化试剂盒(上海博亚生物技术有限公司);DNA Marker,T4DNA连接酶，Eco RI等常规酶(上海Sangon公司)。
13 pESOD质粒提取及鉴定 用质粒快速抽提纯化试剂盒从含pESOD质粒的E.coli DH5α转化菌里提取pESOD质粒，取部分质粒用EcoRI酶切后琼脂糖电泳鉴定，另取部分质粒送上海博亚生物技术有限公司测序。
14 定点突变
141 引物设计 根据hCu，Zn-SOD基因序列和定点突变的要求(将hCu，Zn-SOD中第111位Cys的密码子TGC突变为Ala密码子GCC)设计出一对包含突变位点的引物(正、反向)P1和P2,具体序列如下：P1：5′CTCTCAGGAGACCATGCCATCATTGGCCGCAC 3′；P2：5′GTGCGGCCAATGATGGCATGGTCTCCTGAGAG 3′。下划线的碱基为突变位置。所有引物均由上海博亚生物技术有限公司合成。
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