| | | EB病毒LMP1基因靶向shRNA表达载体构建方法的比较研究
| | 中药师论文【关键词】 疱疹病毒4型,人；RNA干扰；遗传载体
Comparative study between two construction methods of short hairpin RNA expression vector targeting EpsteinBarr virus LMP1 gene
【Abstract】 AIM: To explore the differences between two construction methods of short hairpin RNA expression vector targeting EpsteinBarr virus(EBV) latent membrane protein1(pshLMP1), so as to look for a more stable and convenient way of constructing the special shRNA vector. METHODS: The siRNA coding sequences targeting EBVLMP1 were designed; pshLMP1 expression vector was achieved by the conventional annealing method or PCR method, and the differences of constructive strategies, construction processes and sequencing results between the two methods were analyzed. RESULTS: pshLMP1 expression vector was obtained by both methods but better cloning efficiency was achieved by PCR method with rare base deletion and mutation. CONCLUSION: PCR method is a more efficient way to construct the more stable pshLMP1 expression vector.
【Keywords】 herpesvirus 4, human; RNA interference; genetic vectors
【摘要】 目的中药师论文： 探讨两种构建EB病毒LMP1 基因的中药师论文shRNA表达载体(pshLMP1)方法的不同，寻找更加稳定方便的靶向shRNA表达载体的构建方式. 方法： 设计针对EB病毒LMP1基因的特异siRNA 编码序列，分别应用传统的双链退火法和新颖的双链PCR法构建pshLMP1，比较两种方法在设计原则、构建方法和鉴定结果上的不同. 结果： 两种方法均能得到pshLMP1重组质粒，但是双链PCR法构建效率高且不易引起碱基的缺失和突变. 结论：双链PCR法构建EB病毒pshLMP1表达载体比传统双链退火法更加稳定，构建成功率较双链退火法高.
【关键词】 疱疹病毒4型，人；RNA干扰；遗传载体
0引言
应用RNA干扰技术阻断EpsteinBarr病毒LMP1基因(EBVLMP1)的表达已成为鼻咽癌基因治疗的研究方向之一. 常用的RNA干扰表达载体构建方法为双链退火法，但是由于DNA寡核苷酸单链片段长度在60~70 bp左右，化学合成的错误率高，为EBV-LMP1 基因的RNA干扰载体（pshLMP1）构建带来了不便. 因此我们设计了双链PCR法构建pshLMP1，经过实践证实双链PCR法提高了构建成功率，能够加速RNA干扰技术在鼻咽肿瘤的研究进度.
1材料和方法
1.1材料EBVLMP1mRNA和cDNA序列从GenBank搜索. pTZU6+1载体由重庆医科大学感染性疾病分子生物学重点实验室保存提供，内含有人U6启动子，能在体内转录产生RNA链，含XbaI和SalI克隆位点. DNA寡核苷酸链由上海英骏生物技术有限公司合成. Taq DNA聚合酶，dNTPs及相应buffer,限制性内切酶SalI, XbaI及相应buffer，T4连接酶均购自Takara 公司. 其余试剂均为自行配制. DNA测序工作由重庆医科大学感染性疾病分子生物学重点实验室完成.
1.2方法
1.2.1选择EBVLMP1基因靶位点EBVLMP1 cDNA序列由exon a, b, c三个外显子组成. 在exon c中第747920位碱基中有多个内部重复序列，长度为35 bp： GTCCTGGGACTGTTGTGACTACTGTTACCGGGTGT. 根据siRNA设计原则，选择该重复序列中第323位的21个碱基为靶位点，设计EBVLMP1基因靶向RNA干扰表达载体(pshLMP1).
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